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Revista ISME (2023)Citar este artículo

Detalles de métricas

El análisis multiómico es una poderosa herramienta para la detección y el estudio de interacciones entre reinos, como las que se producen entre bacterias y arqueas miembros de comunidades microbianas complejas productoras de biogás. En el presente estudio, los microbiomas de tres digestores de biogás a escala industrial, cada uno alimentado con diferentes sustratos, se analizaron utilizando un marco de metagenómica centrado en el genoma guiado por aprendizaje automático complementado con datos de metatranscriptoma. Estos datos nos permitieron dilucidar la relación entre las abundantes comunidades metanogénicas centrales y sus socios bacterianos sintróficos. En total, detectamos 297 genomas ensamblados en metagenoma no redundantes (nrMAG) de alta calidad. Además, los perfiles de genes 16 S rRNA ensamblados de estos nrMAG mostraron que el phylum Firmicutes poseía el mayor número de copias, mientras que los representantes del dominio archaeal tenían el más bajo. La investigación adicional de las tres comunidades microbianas anaeróbicas mostró alteraciones características a lo largo del tiempo, pero siguió siendo específica para cada planta de biogás a escala industrial. La abundancia relativa de varios microorganismos según lo revelado por los datos del metagenoma fue independiente de los datos correspondientes de la actividad del metatranscriptoma. Archaea mostró una actividad considerablemente más alta de lo esperado por su abundancia. Detectamos 51 nrMAG que estaban presentes en los tres microbiomas de plantas de biogás con diferentes abundancias. El microbioma central se correlacionó con los principales parámetros de fermentación química, y ningún parámetro individual surgió como formador predominante de la composición de la comunidad. Se asignaron varios mecanismos de transferencia de H2/electrones entre especies a los metanógenos hidrogenotróficos en las plantas de biogás que funcionaban con biomasa agrícola y aguas residuales. El análisis de los datos del metatranscriptoma reveló que las vías metanogénicas eran las más activas de todas las vías metabólicas principales.

En los sistemas de digestión anaeróbica (DA) diseñados, la descomposición de la materia orgánica y la producción de biogás se basan en el reciclaje eficiente de nutrientes [1, 2]. Este proceso involucra una comunidad microbiana diversa, y cada microbio tiene un papel específico. La composición y función de la comunidad microbiana involucrada en las etapas de la EA juegan un papel importante en la eficiencia del proceso general, que también está influenciado por numerosos factores, como las interacciones microbio-microbio, la composición del sustrato, los parámetros fisicoquímicos y las condiciones de operación. [3,4,5,6].

Desentrañar las interacciones microbianas y sus mecanismos subyacentes es una tarea compleja, ya que muchos microbios no pueden sobrevivir sin socios microbianos específicos [7]. Se han desarrollado métodos innovadores para el aislamiento y cultivo microbiano, algunos de los cuales han demostrado tener éxito en el cultivo de nuevos microorganismos [8]. Sin embargo, se necesita un mayor desarrollo y avance de estas tecnologías para desbloquear todo el potencial de la diversidad microbiana [9, 10]. Dado que existen fuertes interacciones sintróficas entre los microbios en los consorcios microbianos de AD, se requiere una investigación profunda para comprender su diversidad, función metabólica y distribución. Estos estudios se han visto obstaculizados inicialmente por las limitaciones inherentes a los métodos microbiológicos dependientes del cultivo, que requieren el aislamiento de microorganismos y pueden ser un desafío cuando las relaciones sintróficas son ubicuas [11,12,13]. Las herramientas bioinformáticas y de secuenciación de alto rendimiento permiten el análisis masivo de material genómico y, por lo tanto, brindan información sobre la taxonomía y las funciones de comunidades microbianas completas [14,15,16].

La identificación y la caracterización del genoma de los microbios que se encuentran comúnmente en los microbiomas de la EA pueden revelar vías cruciales y características ecológicas involucradas en la cadena alimentaria microbiana [17, 18]. Estudios previos que utilizaron la secuenciación de amplicón del gen 16 S rRNA mostraron que los microorganismos centrales crean una comunidad estable capaz de resistir diversas perturbaciones (es decir, cambios en los parámetros de AD) [19,20,21]. Sin embargo, la secuenciación de amplicones y los enfoques metagenómicos basados ​​en lectura pueden no ser capaces de identificar especies desconocidas mediante el análisis del microbioma central debido a su dependencia de las bases de datos de referencia [22, 23]. Además, las comunidades productoras de biogás representan un contingente grande y diverso de microorganismos no caracterizados que se han descrito previamente como "materia oscura microbiana" [19, 24, 25]. Para abordar este problema, se pueden utilizar algoritmos bioinformáticos cada vez más sofisticados para reconstruir los genomas de especies individuales (o MAG: genomas ensamblados en metagenoma) a partir de estas comunidades complejas [26,27,28].

Varios estudios recientes que emplean metagenómica resuelta por genoma han recuperado MAG característicos de reactores de biogás a escala industrial y de laboratorio [23, 29, 30, 31]. Estos estudios revelaron que Bacteroides y Firmicutes tienen interacciones versátiles con metanógenos hidrogenotróficos a través de sus capacidades de producción de H2, CO2 y formato [17, 32]. Además, la concentración de amoníaco es el principal parámetro que da forma a la comunidad metanógena [29]. Es necesario reconstruir fragmentos del genoma a partir del metagenoma de manera eficiente y precisa para explorar estas interacciones in silico [33, 34]. Los estudios publicados recientemente demostraron que el aprendizaje automático semisupervisado podría mejorar significativamente el rendimiento del agrupamiento [35, 36], lo que, combinado con el enfoque metatranscriptómico, puede permitir un examen más profundo de las interacciones microbianas en diferentes entornos.

El presente estudio investigó la estructura y función de los microbiomas en tres reactores de biogás de tamaño industrial, cada uno alimentado con un sustrato característico distinto. Cada reactor fue monitoreado a intervalos estacionales durante un período de un año. Se utilizó la secuenciación de escopeta seguida de un marco de análisis metagenómico y metatranscriptómico centrado en el genoma guiado por aprendizaje automático para identificar la composición microbiana y las actividades metabólicas en curso. La parte compartida de la comunidad microbiana involucrada en la digestión de sustratos heterogéneos se investigó utilizando un concepto de comunidad central basado en la ocurrencia [37]. El principal objetivo de esta investigación fue descubrir la relación entre la abundante población metanogénica central y las bacterias sintróficas particulares. Más específicamente, nos enfocamos en redes clave de sintrofia entre especies y encontramos una correlación intrigante entre los parámetros de fermentación química y la microbiota anaeróbica central presente en los reactores.

Se tomaron muestras de tres digestores anaerobios de última generación en Hungría. Dos de los digestores están en Szeged (MWBP y SZBP), y el otro está en Kecskemét (KBP). Las características clave de cada planta de biogás estudiada aquí se resumen en Supl. Tabla 1. Estas plantas de biogás fueron seleccionadas utilizando los siguientes criterios: (i) los digestores han estado operando sin problemas por más de cinco años; y (ii) los digestores utilizan distintos biopolímeros como principal sustrato de descomposición para la producción de biogás. El muestreo se realizó durante un período de un año en los siguientes intervalos (estacionales): octubre de 2020, enero de 2021, abril de 2021 y julio de 2021. Las muestras se transportaron directamente al laboratorio y se procesaron inmediatamente después de su llegada. Las mediciones de los parámetros AD y la purificación de ADN/ARN se realizaron en muestras frescas de plantas de biogás (BP) por triplicado (es decir, triplicados biológicos: n = 3).

Para cada BP, medimos: pH del lodo, relación carbono-nitrógeno (C/N), contenido de sólidos totales (TS), contenido de sólidos volátiles (VS), nitrógeno amoniacal total (TAN; es decir, iones de amonio y amoníaco disuelto), contenido de sólidos volátiles contenido de ácidos orgánicos (VOA) y carbono inorgánico total (TIC). Las medidas se tomaron como se publicó anteriormente [38].

Se realizaron pruebas por lotes de potencial bioquímico de metano (BMP) en recipientes de reactor de 160 ml (botella de suero de vidrio Wheaton, Z114014 Sigma-Aldrich) que contenían 60 ml de fase líquida. La relación inóculo (contenido de BP filtrado para eliminar partículas mayores de 2 mm) a sustrato (α-celulosa: C8002 Sigma-Aldrich) se fijó de acuerdo con el estándar VDI 4630 (Vereins Deutscher Ingenieure 4630, 2006) en la relación inóculo a sustrato VS = 2:1. Se puede encontrar una descripción detallada de los procedimientos de muestreo y medición de gases en una publicación anterior [39].

Se obtuvieron alícuotas de 2 mL de las muestras de cada BP para el aislamiento total de ADN y ARN de la comunidad. La purificación se realizó por triplicado y las extracciones resultantes se agruparon. Todas las extracciones se llevaron a cabo utilizando kits de minipreparación de ADN/ARN ZymoBIOMICS (R2002, Zymo Research, Irvine, EE. UU.). Después de la lisis (la homogeneización de las perlas se realizó con un Vortex Genie 2 con un tamaño de perla de 0,1 mm, un tiempo de homogeneización de 15 min y a la velocidad máxima), se siguió el protocolo de purificación de ADN y ARN en paralelo del kit Zymo Research. Las cantidades de ADN y ARN se estimaron utilizando una Agilent 2200 TapeStation (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.).

Seguimos de cerca todas las recomendaciones del fabricante para la plataforma de secuenciación Illumina (Illumina Inc., San Diego, EE. UU.). Se usaron muestras de ADN genómico agrupadas para secuenciar bibliotecas construidas con el kit de preparación de bibliotecas NEBNext Ultra II (NEB, Ipswich, EE. UU.). La secuenciación metagenómica de extremos emparejados se realizó en un secuenciador NextSeq 550 (Illumina) utilizando el kit de reactivos de secuenciación NextSeq High Output Kit v2. La secuenciación del metatranscriptoma a partir de muestras de ARN agrupadas se realizó de la siguiente manera: las bibliotecas se prepararon primero con un kit de biblioteca de ARN total Zymo-Seq RiboFree, que incluye un paso universal de agotamiento de ARNr. A continuación, se realizó la secuenciación de ARNm de extremo emparejado en un secuenciador NextSeq 550 (Illumina) utilizando el kit de reactivos de secuenciación NextSeq High Output Kit v2. El análisis de datos primarios (es decir, llamada de base) se realizó utilizando el software "bcl2fastq" (versión 2.17.1.14, Illumina). Los parámetros característicos de los fragmentos se resumen en la Tabla complementaria 2.

Las secuencias sin procesar se filtraron mediante fastp (versión 0.23.2, longitud requerida: 150 pb) y se verificaron con FastQC (versión 0.11.8). Las secuencias filtradas producidas por fastp luego fueron coensambladas por separado por Megahit (versión 1.2.9, 4 muestras por BP = 3 coensamblajes). Los ajustes utilizados fueron los siguientes: longitud mínima de contig = 1500; tamaño mínimo de k-mer = 21; tamaño máximo de k-mer = 141 [40]. El procedimiento de binning de metagenómica se realizó por separado para cada conjunto de datos de metagenómica de AD hasta el paso de desreplicación. Usamos Anvi'o (versión 7: "esperanza") para crear la base de datos contig para el siguiente flujo de trabajo metagenómico [41].

La reconstrucción del genoma se realizó con Semibin (versión 1.1.1), un paquete de software guiado por aprendizaje automático que combina un enfoque semisupervisado con redes neuronales siamesas profundas mediante el uso de un flujo de trabajo de binning de coensamblaje avanzado con un modo semisupervisado [35 ]. Para la desreplicación y la filtración de calidad de genomas ensamblados en metagenoma (MAG), usamos dRep (versión 2.2.3) y CheckM2 (versión 1.0.1) con los siguientes parámetros: dereplicate: comp 10, con 5, S_algorithm fastANI, sa 0.95, y predecir la función en el caso de CheckM2 [42, 43]. Vale la pena señalar que dRep usa CheckM1, por lo que la contaminación de nrMAG puede diferir de la configuración de filtrado de dRep (Tabla complementaria 3). MarkerMAG se usó en modo predeterminado para detectar, ensamblar y vincular genes de ARNr 16 S a MAG y calcular el número de copias correspondiente (matam_16s: pct 5,10,25,50,75,100 –i 0.99, y función de enlace en parámetros predeterminados) [ 44].

Los marcos abiertos de lectura (ORF) fueron identificados por Prodigal (versión 2.6.3). Se usó InterProScan versión 5.31–70 para anotar funcionalmente las secuencias de codificación de genes usando la base de datos Pfam [45]. Los perfiles funcionales se complementaron con datos de los módulos de funciones de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) de Anvi'o (anvi-run-kegg-kofams) [46]. Las enzimas involucradas en la utilización de carbohidratos se identificaron mediante una combinación de perfiles funcionales de Pfam y datos de la base de datos de enzimas activas de carbohidratos (CAZy) [47]. Luego utilizamos la base de datos taxonómica del genoma (GTDB: versión 207) con GTDB-Tk (versión 2.1.1) para la asignación taxonómica [48]. Los MAG no redundantes reconstruidos (nrMAG) que mostraron una integridad superior al 90 % también se compararon con las entradas en la base de datos Biogas Microbiome [29] usando fastANI (versión 1.33) [49]. Las estadísticas de nrMAG se resumen en la Tabla complementaria 3.

Los valores de abundancia de nrMAG en cada muestra se calcularon con el módulo MetaWRAP (versión: 1.3.2) quant_bin (usando Salmon), similar al proceso de cálculo TPM (transcripción por millón), que aquí se refiere a "copias por millón de lecturas" ( CPM, Tabla Suplementaria 4) [50]. Las lecturas se alinean con contigs de nrMAG y los valores de cobertura resultantes se estandarizaron por tamaño de muestra (por cada millón de lecturas metagenómicas) y por longitud de contig (en nucleótidos). Los árboles filogenómicos se generaron utilizando un conjunto de 120 genes básicos de copia única (SCG) bacterianos y 53 arqueales a través de GTDB-Tk (versión 2.1.1; classify_wf) e IQTree2 (versión 2.2.0.3) utilizando los siguientes parámetros: número de arranques: 1000; iteración máxima: 1000; regla de parada: 100 [51, 52]. Se empleó la herramienta interactiva Tree of Life (iTOL: versión 6.7.3; https://itol.embl.de/) para visualizar el árbol filogenómico, así como algunos resultados de clasificación.

Primero extrajimos ORF de MAG usando bedtools: getfasta (versión: 2.27.1) para obtener llamadas de genes específicas de MAG. Luego los combinamos para crear un índice Salmon (usando el parámetro keepDuplicates; https://github.com/COMBINE-lab/salmon). Los recuentos de lectura se calcularon con Salmon (versión 1.8.0) en modo cuasi-mapeo con corrección de sesgo de GC (gcBias). El archivo de salida principal (quants.sf) contiene el número cuantificado de lecturas (numReads) y su cantidad en valores TPM (Tabla complementaria 5). El proceso de cálculo de TPM (utilizado como métrica de actividad en el presente estudio) se realizó de manera similar a lo mencionado anteriormente, tomando el gen ponderado por longitud efectivo (sesgo de GC) y lecturas transcriptómicas mapeadas por correcciones de muestra.

Los resultados de las pruebas de BMP se visualizaron mediante ggplot2 (versión 4.1.3) y las diferencias significativas entre los potenciales máximos de biogás (es decir, de las pruebas por lotes con α-celulosa) se calcularon con el paquete ggsignif (versión 0.6.4) (es decir, con un valor entre -prueba de pares de Wilcoxon, con ANOVA de una vía para comparar múltiples grupos) [53]. MicroViz (versión 0.9.0) [54] visualizó la escala multidimensional de las muestras (es decir, gráficos MDS para mostrar las diferencias de Bray-Curtis), la abundancia de MAG y los valores de actividad. Se calcularon las distancias euclidianas y las diferencias entre las muestras (mediante el análisis de varianza multivariante permutacional; PERMANOVA: n_perms: 1000) y se visualizaron mediante el paquete microeco R (versión 0.14.1) [55]. Para evaluar la importancia de las diferencias entre MAG, utilizamos lefser (el paquete R para la calculadora del tamaño del efecto del análisis discriminante lineal; versión 4.3) dentro de microeco, con un umbral significativo de p ≤ 0.05 (trans_diff: alpha = 0.05, p_adjust_method = fdr, lefse_min_subsam = 10, lefse_norm = 1e + 06, botas = 30) [56].

Luego analizamos los datos de ocurrencia para identificar el microbioma central. Un taxón observado en el 83,3 % de las muestras (es decir, en 10 de 12) con una abundancia superior a 1 (~10x cobertura del genoma) se consideró miembro del microbioma central [37]. Los paquetes ggvenn y ggtern (versiones 0.1.10 y 3.4.1) se utilizaron para visualizar la distribución del microbioma central (a nivel de especie y phylum) entre los BP [53]. microeco [55] calculó el análisis de co-ocurrencia y las correlaciones entre los parámetros de AD y las identificaciones taxonómicas de los miembros del microbioma central (a nivel de especie o al nivel taxonómico más alto). Se utilizó NetComi (construcción y comparación de redes para datos de microbioma; versión 1.1.0) para calcular y normalizar la matriz de asociación (trans_network: cor_method = pearson, use_NetCoMi_pearson_spearman = TRUE, filter_thres = 0.001, luego cal_network: COR_p_thres = 0.01, COR_cut = 0.7) [57, 58]. Se utilizó el paquete ggraph (versión 2.1.0) para visualizar las correlaciones. Para revelar las correlaciones entre los microorganismos y los parámetros químicos, se empleó la función trans_env (use_data = especies, cor_method = pearson, p_adjust_method: fdr).

Circos online (http://circos.ca/) y ggplot2 visualizaron los resultados de los análisis metagenómicos y metatranscriptómicos de las enzimas activas en carbohidratos. La expresión génica diferencial y el análisis de enriquecimiento se realizaron mediante el paquete DESeq2 (1.34.0) implementado en R [59]. Los archivos cuantitativos de salmón (quants.sf) se importaron en R con tximport (versión 1.22.0; configuración: tipo = salmón, txOut = TRUE) (https://github.com/mikelove/tximport). Filtramos los recuentos para retener genes con un mínimo de 5 lecturas en 4 muestras obtenidas de alineaciones de Salmon (numReads) y normalizadas por DESeq2 (con parámetros predeterminados; Tabla complementaria 5). Finalmente, para visualizar genes significativamente diferentes, usamos el paquete ggplot2 (usando la siguiente configuración: log2 FC: ≥2.0, p ≤ 0.05).

Se recolectaron muestras de los digestores anaeróbicos de tres BP a escala industrial ("muestras AD" y Tabla complementaria 1). KBP se alimentaba principalmente con estiércol de pollo y paja de trigo pretratada; SZBP se alimentó con purín de cerdo y ensilaje de maíz; y lodos de aguas residuales municipales tratados con MWBP que contienen diversos materiales. Todos los digestores se operaron a temperaturas mesófilas (es decir, de 36 °C a 38 °C) en reactores de tanque con agitación continua. Durante el período de monitoreo estacional (es decir, cuatro puntos de muestreo por BP), todos los reactores operaron de manera estable y no se informaron fallas.

Se realizaron pruebas estándar de BMP (ver detalles en "Determinación de los parámetros químicos de AD") para medir el potencial máximo de biogás de las diferentes comunidades de AD. Los rendimientos de metano variaron de 340 mL (desviación estándar: 2,6 mL) a 376 mL g VS−1 (DE: 14,6 mL). Aunque el inóculo para las pruebas de BMP se originó en digestores alimentados con distintos sustratos, los rendimientos de metano fueron muy similares (Fig. 1A). Además, las pruebas de los puntos temporales de octubre, enero, abril y julio mostraron rendimientos de metano similares entre las tres plantas de biogás (Fig. 1B; para abril: KBP = 362 ± 14,6; MWBP = 356 ± 2,4; y SZBP = 365 ± 7,6 mL metano g VS−1). En investigaciones anteriores, se observaron rangos de potencial de metano similares en BP que digieren diversos tipos de biomasa de origen agrícola o municipal [60,61,62].

A Resultados de las mediciones de prueba de BMP estándar de tres BP (consulte: "Muestras de AD"). B BMP rendimientos de metano durante los períodos de prueba. C Parámetros químicos de digestión anaeróbica del lodo de digestores BP individuales (relación carbono/nitrógeno C/N, nitrógeno amoniacal total TAN, ácidos orgánicos volátiles VOAs, carbono inorgánico total TIC, sólidos totales TS, sólidos volátiles VS). Las diferencias de medias se analizaron mediante ANOVA y se consideraron estadísticamente significativas de la siguiente manera: p < 0,05 (*), p < 0,001 (**), ns ninguna diferencia significativa.

Aunque los principales parámetros del proceso químico estuvieron dentro de los rangos óptimos [63,64,65], mostraron claras diferencias entre los tres reactores BP (Tabla complementaria 1). Se midieron los siguientes parámetros: ácidos orgánicos volátiles (VOA), carbono inorgánico total (TIC), nitrógeno amoniacal total (TAN), relación carbono-nitrógeno (C/N), sólidos totales (TS) y sólidos volátiles (VS ). De estos, las concentraciones de C/N, VOA y TAN mostraron la mayor variabilidad entre los BP (ANOVA: p < 0.05) (Fig. 1C). Estos valores fueron típicamente más bajos en MWBP (p < 0,01) en comparación con los de KBP y SZBP [66].

El agrupamiento semisupervisado complementado con aprendizaje automático (ML) es un enfoque desarrollado recientemente que ha demostrado ser muy beneficioso para ampliar el conocimiento de la genómica microbiana. Investigaciones anteriores han demostrado que un modelo específico de hábitat basado en ML mejora el proceso de agrupamiento de metagenomas para microbiomas complejos, superando la composición de nucleótidos no supervisada existente y los métodos basados ​​​​en la abundancia (es decir, Metabat2) [35, 36]. Sin embargo, debido a la profundidad de lectura inusual y la composición de nucleótidos atípica, los genes de ARN ribosomal frecuentemente están ausentes de los MAG recuperados de los datos de secuenciación de lectura corta [34, 44]. Estos genes son esenciales para estudiar la genómica y la filogenia de microorganismos no cultivados y permiten análisis que conectan datos MAG con bases de datos de genes 16 S rRNA.

En el presente estudio, más de 296 millones de lecturas de secuencias metagenómicas pasaron el paso de filtrado (con un promedio de 24,6 millones de lecturas por muestra). Las lecturas filtradas fueron coensambladas por Megahit (tres ensamblajes independientes por BP), lo que resultó en un total de 283 491 contigs (KBP: 107 920; MWBP: 98 415; SZBP: 77 156 contigs; para obtener detalles, consulte: Supl. Tabla 2). Se siguió una estrategia de metagenómica centrada en el genoma para cada conjunto de cóntigos coensamblados. El conjunto de MAG desreplicado y filtrado por calidad se usó luego para un análisis adicional. Semibin produjo 297 nrMAG (nr = no redundante), de los cuales 107 (36 %) tenían más del 90 % de integridad. Cabe señalar que el 6 % de los nrMAG se identificó con un 0 % de contaminación y otro 90 % con >5 % de contaminación mediante el análisis CheckM2 (Fig. 2A y B). Además, el 24 % de los nrMAG (n = 70) se identificaron con un nivel de calidad superior al de sus representantes en la base de datos de taxonomía del genoma (tabla complementaria 3). Estas observaciones confirman la efectividad de Semibin como un procedimiento de clasificación para comunidades productoras de biogás anaeróbicas complejas [35]. Además, la mayor cantidad de nrMAG únicos agrupados por Semibin también puede conducir a un mejor mapeo de los datos del metatranscriptoma.

Una comparación de la integridad y contaminación de los genomas ensamblados en metagenomas no redundantes (nrMAG) producidos por Semibin y analizados por CheckM2 utilizando el conjunto predeterminado de SCG. B Distribución de nrMAG reconstruidos por Semibin en función de la integridad y la contaminación. Teniendo en cuenta que dRep emplea CheckM1, la contaminación de nrMAG puede diferir de la configuración de filtrado de dRep. C Número estimado de copias del gen 16 S rRNA para 22 phyla (es decir, dos taxones de Archaea y 20 de Bacteria). Para algunos filos, fue posible determinar el número de copias de un representante: Methanobacteriota, Firmicutes F, Firmicutes D, Planctomycetota, Proteobacteria y Thermotogota.

Luego se usó el programa MarkerMAG para detectar, ensamblar y vincular genes 16 S rRNA de metagenomas a MAG y para estimar el número de copias (consulte: Materiales y métodos "Ensamblaje y agrupación de metagenomas" y la Tabla complementaria 3) [44]. En el presente estudio, se detectaron 16 genes S rRNA (longitud mínima: 1200 nucleótidos) en 82 nrMAG distribuidos en 22 filos (que representan el 28 % de todos los nrMAG). Los representantes de Firmicutes poseían el número de copias medio estimado más alto de este gen (3,6 copias), mientras que los miembros de Halobacteriota y Methanobacteriota mostraban los números de copias más bajos, con un promedio de 1,3 copias cada uno (Fig. 2C). Junto con informes científicos anteriores, nuestros datos sugirieron que la secuenciación de amplicón de los genes 16 S rRNA subestimó la abundancia de la comunidad de arqueas en la EA [67, 68]. Un método para estimar mejor la abundancia microbiana derivada de la secuenciación del gen 16 S rRNA es normalizar los resultados a través del número de copias por genoma detectado [69]. Sin embargo, el número real de copias del gen 16 S rRNA es desconocido para muchos procariotas [34]. Las soluciones bioinformáticas actuales para normalizar los datos de secuenciación de amplicones se basan en la conservación filogenética aparente de las copias de genes individuales, y esta suposición solo puede ser válida para distancias filogenéticas cortas [70]. La metagenómica resuelta en el genoma combinada con la detección del gen 16 S rRNA puede ayudar a cerrar esta brecha de conocimiento.

En general, encontramos que los tres reactores AD albergaban distintas comunidades microbianas. El escalado multidimensional (MDS; implementado usando la medida de disimilitud de Bray-Curtis) reveló que la variación en la composición del microbioma en las tres plantas de biogás fue significativamente mayor (PERMANOVA: p = 0,001) que la variación en la estructura del microbioma en diferentes puntos de muestreo de cada biogás individual planta. Los microbiomas de las diferentes BP mostraron cambios característicos a lo largo del tiempo, pero en cada caso, estos cambios fueron distintivos para esa planta (Fig. 3A). Este hallazgo fue confirmado por los cálculos de la distancia euclidiana, que indicaron que los microbiomas de KBP y SZBP eran más similares entre sí que con MWBP (Fig. 3B). De acuerdo con investigaciones anteriores, nuestros análisis confirmaron que los microbiomas KBP y SZBP contenían predominantemente Bacteroidia, Clostridia y Limnochordia, mientras que el microbioma MWBP contenía Bacteroidia, Anaerolineae y Actinomycetia (Fig. 3D) [29, 31, 71]. Por lo tanto, podemos concluir que existe un paisaje de comunidad microbiana común que incluye los principales taxones que se encuentran en los digestores de biogás estudiados aquí [3, 4].

Un escalado multidimensional de muestras. Esta medida indica las diferencias de Bray-Curtis de la comunidad microbiana al nivel de anotación de especies o superior. Cada símbolo está relacionado con una muestra de PA específica. Oct, Ene, Abr y Jul, indican los meses en que se recolectaron las muestras. B Distancia euclidiana de muestras de BP. Esta medida representa la disimilitud de las comunidades microbianas a nivel de anotación de especies o superior. C Distribución taxonómica de nrMAGs a nivel de dominio para los tres BPs (en CPM %). D Distribución taxonómica de nrMAG. Esto muestra los taxones más abundantes en las doce muestras tomadas (es decir, cada par de puntos BP-tiempo) resueltos al nivel taxonómico de clase (mostrado en % CPM). Los nombres rojos indican que no están entre las 15 clases más activas. E La actividad metatranscriptómica general de los microorganismos arqueales involucrados en diferentes vías metanogénicas (mezcla: indica aquellos nrMAG que son capaces de utilizar las tres vías metanogénicas). F Actividad metatranscriptómica acumulativa de nrMAG en el nivel taxonómico del dominio para los tres BP (mostrado en TPM %). G La actividad metatranscriptómica de nrMAG. Se muestran los taxones más activos presentes en las doce muestras tomadas (es decir, cada par de puntos BP-tiempo) resueltos al nivel taxonómico de clase (mostrado en TPM %). Los nombres rojos indican que no se encuentran entre las 15 clases más abundantes.

El examen de la abundancia y actividad microbiana utilizando distribuciones de datos de metagenoma y metatranscriptoma reveló patrones distintos. Con base en la abundancia relativa (%CPM), las tres clases principales encontradas fueron Bacteroidia, Clostridia y Limnochordia, aunque la actividad (TPM%) de Methanosarcina superó a los miembros de estas clases. Además, también encontramos diferencias sorprendentes en el rango y la composición taxonómica entre los 15 nrMAG más activos en comparación con las clases microbianas más abundantes (Fig. 3D y G). Por lo tanto, la abundancia relativa de microorganismos es divergente de la actividad metatranscriptómica relativa. En general, los representantes del dominio Archaea mostraron actividades más altas que la abundancia, como se evidencia al comparar los valores de TPM% con CPM% (Fig. 3C y F; Tablas complementarias 4 y 5). Este fenómeno también se observó en una comunidad productora de biogás anaeróbico [72].

Las arqueas metanogénicas identificadas a través de la metatranscriptómica no exhibieron diferencias significativas en la actividad general en las tres plantas de biogás a escala industrial (Fig. 3E). Esta observación indica que las arqueas metanogénicas exhiben una funcionalidad comparable, a pesar de las variaciones en las condiciones y parámetros entre las diferentes instalaciones de biogás. Esta resiliencia puede deberse a la diversidad de arqueas metanogénicas en los digestores, que pueden proporcionar redundancia a la comunidad productora de metano [19, 73,74,75].

Según los conjuntos de genes marcadores específicos de linaje (SCG) conocidos y los datos de MIMAG, detectamos 36 % de nrMAG de calidad alta, 34 % de calidad media y 30 % de calidad baja [76]. Luego se empleó la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB) para la asignación taxonómica de nrMAG reconstruidos. Estos resultados mostraron que los nrMAG se podían clasificar en 33 phyla, de los cuales tres pertenecían a Archaea y 30 a Bacteria (Fig. 4 y Tabla complementaria 3).

El color de fondo del árbol filogenético interno marca el filo al que pertenecen. El primer anillo muestra el número nrMAG. En los siguientes dos anillos, los símbolos representan la presencia de nrMAG específicos en las bases de datos Biogas Microbiome (verde) y GTDB (naranja). Los símbolos rojos marcan los siete nrMAG que están muy completos (>90 %), baja contaminación (<5 %) y no se han encontrado en ninguna base de datos disponible (Archaea: MAG_165_3; Bacteria: MAG_114_1, _18_1, 29_1, 77_1, 87_1 y 95_2). Los símbolos morados representan los nrMAG principales. El anillo exterior representa bacterias que son significativamente más prevalentes en el BP particular (usando lefser, p < 0.05).

Los nrMAG se compararon con la base de datos Biogas Microbiome, utilizando la herramienta fastANI para calcular la identidad de nucleótidos promedio (ANI) [29]. Esta base de datos contiene un conjunto completo de genomas microbianos encontrados previamente en digestores de biogás. Descubrimos que el 83 % de los nrMAG de alta calidad reconstruidos (completitud >90 %; n = 107) estaban presentes en la base de datos de Biogas Microbiome (límite ANI: 95 %). Vale la pena señalar que siete nrMAG de alta calidad, que representaron el 7 % del total de nrMAG de alta calidad (n = 107) y el 2 % de todos los nrMAG (n = 297), no pudieron asociarse con un representante más cercano en ninguno de los dos. base de datos. Estos nrMAG se consideraron novedosos porque no cumplían con los siguientes criterios: identificación a nivel de especie con un radio de referencia del 95 % para GTDB y ≥95 % de ANI para el microbioma de biogás (Fig. 4 y Tabla complementaria 3). Se encontró que tres nrMAG de alta calidad también contenían secuencias del gen 16 S rRNA (Tabla complementaria 3). Además, los siete supuestos nuevos nrMAG demostraron una gran abundancia y actividad, representando el 3 % del recuento total por millón (CPM) y el 5 % del total de transcripciones por millón (TPM), respectivamente, en el microbioma examinado. Estos nrMAG pueden ser miembros de la materia oscura microbiana hipotética que ahora se puede liberar en el ámbito de los participantes conocidos en las comunidades de AD.

El análisis del microbioma central basado en la metagenómica centrado en el genoma se utilizó para identificar taxones potencialmente relevantes que pueden desempeñar un papel en la configuración de la comunidad microbiana central. Por lo tanto, este estudio macroecológico fue respaldado por datos de metatranscriptoma (Fig. 5 y Fig. 1 complementaria) [37]. Estos análisis brindan información sobre la relación entre nrMAG y los parámetros de AD, así como sus funciones en la configuración del microbioma central.

Un diagrama de Venn indica el número total de nrMAG y el número de nrMAG compartidos entre los tres BP (porcentajes como se indica). B Gráfico ternario que muestra la distribución de nrMAG bacterianos y arqueales entre BP. El color del punto representa el filo al que pertenecen los nrMAG. El tamaño del punto es proporcional a la abundancia total (es decir, el valor CPM acumulativo en todos los BP) de nrMAG específicos.

El examen de la distribución de nrMAG reconstruidos en plantas de biogás específicas reveló que MWBP poseía el microbioma más exclusivo de los tres sistemas investigados. KBP y SZBP mostraron microbiomas algo superpuestos, como lo demuestran los cálculos de distancia euclidiana y MDS. No obstante, detectamos 51 nrMAG en los tres digestores (Fig. 5A). La mayoría de los nrMAG principales identificados eran representantes de bacterias hidrolizantes bien conocidas (p. ej., Firmicutes, Bacteriodota) y metanógenos con actividades metabólicas versátiles (p. ej., Halobacteriota, Methanobacteriota). Estos microorganismos juegan un papel importante en el mantenimiento de la productividad del biogás y el rendimiento sostenible del sistema [14, 77]. Aunque algunos nrMAG estuvieron presentes en todos los digestores, su abundancia varió considerablemente. Entre las bacterias centrales, los filos Firmicutes, Firmicutes A y Bacteriodota se encontraron tanto en SZBP como en KBP, mientras que los miembros de Verrucomicrobiota, Armatimonadota y Chloroflexota predominaron en MWBP [6, 29, 66] (Figs. 4 y 5B).

Se realizó un análisis de coocurrencia de nrMAG y se calcularon sus correlaciones con los parámetros químicos de AD ("Análisis estadístico") (Fig. 6). El análisis de red de co-ocurrencia demostró que la mayoría de los metanógenos exhibieron una correlación positiva con los filos Bacteroidota y Firmicutes. Los principales parámetros que influyeron en la abundancia de microorganismos centrales fueron TAN, VOA y TIC (rho de Pearson > 0,5). En base a esta observación, se trazaron ocho grupos que muestran correlaciones características con los parámetros químicos de AD (Fig. 6B). Los ocho grupos se pueden dividir en dos grupos, con microorganismos de los grupos I–V correlacionados positivamente con los principales parámetros de influencia y microorganismos de los grupos VI–VIII correlacionados negativamente con estos parámetros. También encontramos que los nrMAG principales pertenecientes a los filos Firmicutes, Spirochaetota y Methanobacteriota se correlacionaron positivamente con TAN, VOA y TIC, mientras que los miembros del filo Bacteroidota también se correlacionaron con muchos de los parámetros medidos. Finalmente, la relación C/N mostró un impacto más pronunciado en Bacteroidota que en Firmicutes entre los nrMAG de núcleo superior (Fig. 6B).

Correlaciones de Pearson entre nrMAG centrales. La robustez se calcula bajo el valor de p significativo ajustado que es ≤0,05 y el índice de correlación (rho de Pearson) es > 0,7 según la red. Las líneas azules representan correlaciones positivas (rho de Pearson > 0,7), las líneas rojas representan correlaciones negativas (rho de Pearson < −0,7). Un filo marcado con un asterisco no está presente entre los microorganismos correlativos. B Correlaciones de Pearson entre los nrMAG centrales y los parámetros químicos AD medidos. Los asteriscos representan las correlaciones significativas (consideradas estadísticamente significativas de la siguiente manera: p < 0,05 (*), p < 0,001 (**), p < 0,0001 (***), ns (sin diferencia significativa)). Usando el cladograma que se muestra a la izquierda y los datos de TAN (nitrógeno amoniacal total), VOA (ácidos orgánicos volátiles), TIC (carbono inorgánico total), TS (sólidos totales) y C/N (relación carbono a nitrógeno), se seleccionaron ocho grupos. distinguido. Estos se muestran aquí separados por color de la siguiente manera: Grupo I: gris; Grupo II: marrón; Grupo III: amarillo; Grupo IV: verde; Grupo V: púrpura; Grupo VI: azul; Grupo VII: naranja; y Grupo VIII: verde oscuro. Los cuadros de colores representan los filos específicos a los que pertenecen los nrMAG. Los puntos rojos representan los nrMAG hidrolizados superiores (n = 10).

Se descubrió que el género Methanoculleus (phylum Halobacteriota, que representa a los metanógenos hidrogenótrofos) es una comunidad diversa en el microbioma central. Las especies representativas de Methanoculleus que exhibieron una correlación positiva con las concentraciones de TAN y VOA fueron predominantes en KBP y SZBP, mientras que aquellas con una correlación negativa fueron más frecuentes en MWBP. Además, coincidieron con miembros de los filos Bacteroidota y Firmicutes. Los microorganismos pertenecientes a los filos Bacteroidota y Firmicutes pueden producir ácidos orgánicos, alcoholes, hidrógeno (H2) y dióxido de carbono (CO2) a través de la acidogénesis y la acetogénesis, y muchos de estos microorganismos existen en sintrofia con metanógenos acetotróficos e hidrogenotróficos. Los metanógenos hidrogenotróficos consumen hidrógeno a través de la transferencia de hidrógeno entre especies (IHT) y utilizan la energía obtenida de la reducción de CO2 a metano [78]. Los microorganismos metanogénicos que consumen hidrógeno pueden capturar rápidamente hidrógeno y mantener la presión parcial de hidrógeno en un nivel bajo. Esto conduce a una condición termodinámicamente favorable para que las bacterias acetogénicas productoras de hidrógeno descompongan los compuestos orgánicos en acetato, H2 y CO2 [14, 79, 80].

Dos especies de arqueas metanogénicas, Methanoculleus sp002497965 y Methanospirillum sp0125200015 (designadas MAG_26_2 y MAG_103_2), se encontraron en el Grupo VI y mostraron una correlación negativa con Methanoculleus bourgensis y la especie 1 de Methanoculleus pertenecientes a los Grupos II y III. MAG_26_2 y MAG_103_2 estaban comúnmente presentes en el microbioma MWBP (Fig. 4). Methanoculleus sp002497965 y Methanospirillum sp0125200015 se identificaron originalmente en los microbiomas de la EA, pero hasta donde sabemos, no se dispone de información detallada sobre estos microorganismos [81,82,83,84].

En el presente estudio, MAG_26_2 y MAG_103_2 se clasificaron como metanógenos hidrogenotróficos estrictos mediante datos de metatranscriptómica. Además, mostraron una correlación negativa con las concentraciones de TAN y VOA (rho de Pearson > −0,7). Según los datos genómicos, estas arqueas pertenecen a la clase de metanógenos capaces de mantener la metanogénesis hidrogenotrófica utilizando formiato como donante de electrones. Por lo general, el formiato se oxida a CO2 por la formiato deshidrogenasa, después de lo cual se reduce aún más a metano [85]. Aquí, la transferencia de formiato entre especies (IFT) fue mantenida por socios microbianos, a saber, SR-FBR-E99 sp002497965 y LD21 sp012519515 (del filo Bacteroidota; MAG_72_3 y MAG_394_2), que se correlacionaron positivamente con MAG_26_2 y MAG_103_2 (Fig. 6A). Estos MAG se han detectado previamente en digestores de biogás y se describieron por su versátil capacidad hidrolizante. Aparte de la utilización de carbohidratos, son microorganismos degradadores de proteínas y aminoácidos capaces de producir formiato. También se detectaron consistentemente junto con metanógenos que utilizan formiatos [86].

Entre los abundantes núcleos nrMAG presentes, identificamos Methanothrix sp016706325 (MAG_97_2), una arquea que aparentemente es capaz de metanogénesis acetotrófica (Fig. 1 complementaria). Según su perfil de metatranscriptoma MAG, realiza principalmente metanogénesis acetotrófica y puede absorber electrones a través de la transferencia directa de electrones entre especies (DIET) para impulsar la metanogénesis reductora de CO2. Nuestros datos indican que posee vías de biosíntesis de acetil-CoA y F420 altamente activas, así como transferencia de electrones activa asociada a la membrana (proteína transmembrana del citocromo C; Tabla complementaria 4). Según un estudio anterior, las especies de Methanothrix exhiben una mayor actividad cuando derivan una parte de su energía de la DIETA en lugar de depender únicamente del acetato. Sin embargo, la información sobre sus socios sintróficos naturales es limitada [87]. Esta archaeon (con Methanospirillum sp0125200015), está estrechamente asociada con Methanoculleus sp002497965. Se ha detectado que esta red de arqueas coexiste con los microorganismos degradadores de aminoácidos mencionados anteriormente (Fig. 6A). Estos microorganismos también tienen citocromos de tipo C activos y capacidad de síntesis de pili, los cuales son esenciales para la DIETA (MAG_72_3 y MAG_394_2; Tabla complementaria 5) [79, 88,89,90]. Durante los procesos metabólicos, los electrones pueden generarse y transportarse mediante la reducción de equivalentes como la ferredoxina reducida. Para reoxidar estos transportadores de electrones, la producción de formiato puede permitir el uso de rutas de eliminación de electrones para conservar energía [86]. Por lo tanto, Methanothrix_sp016706325 (MAG_97_2) puede desempeñar un papel esencial en la comunidad productora de biogás al respaldar las rutas de eliminación de electrones [91]. Según los datos de la literatura científica, así como un análisis exhaustivo de los digestores anaeróbicos en las plantas de tratamiento de aguas residuales danesas, los representantes de Methanothrix mostraron una correlación negativa con las concentraciones de acetato y TAN [66, 92, 93].

Las correlaciones entre las comunidades microbianas y los parámetros del proceso químico implican un mecanismo distinto de transferencia de electrones durante la DA de la biomasa agrícola y las aguas residuales. Estos procesos están negativamente correlacionados con los niveles de VOA y TAN y comúnmente ocurren cuando las rutas de eliminación de electrones son abundantes. Por ejemplo, nuestros datos y estudios previos sugieren que los microorganismos que hidrolizan proteínas y degradan aminoácidos, que según la taxonomía GTDB pertenecen al filo Bacteroidota y la familia VadinHA17 (Tabla complementaria 3), construyen relaciones sintróficas con metanógenos hidrogenotróficos para mantener la producción de formiato. y disponer de electrones a través de la DIETA [86].

Las enzimas activas de carbohidratos (CAZymes) son responsables de la descomposición de los carbohidratos poliméricos. Para caracterizar este paso limitante de la velocidad, se consultó el conjunto de datos del metatranscriptoma en busca de varios CAZymes y signos de actividad de CAZyme utilizando un conjunto de datos combinado basado en las bases de datos Pfam y CAZy (Fig. 7). Los CAZymes identificados se vincularon luego a nrMAG (ver: "Ensamblaje y agrupación de metagenoma").

Un gráfico de Circos que ilustra las clases de CAZyme identificadas y su distribución de actividad en los filos bacterianos. Las enzimas se agruparon en cinco clases de CAZyme. Las glicosiltransferasas (GT) mostraron la mayor actividad, seguidas de las glucósido hidrolasas (GH), los módulos de unión a carbohidratos (CBM), las esterasas de carbohidratos (CE) y las liasas de polisacáridos (PL). En general, se detectó actividad de GH y GT en todos los filos microbianos observados. La mayor parte de la actividad de CBM (51% TPM) estuvo relacionada con Firmicutes y Bacteroidota. B Mapa de calor de familias de enzimas de glucósido hidrolasa (GH) ampliamente distribuidas y comunes. La actividad de GH se especifica mediante recuadros de colores. C Mapa de calor de las actividades del módulo de unión a carbohidratos (CBM) y las familias de enzimas de glucósido hidrolasa (GH) para las 30 especies microbianas principales (mostrado en valores log10 TPM). Los puntos rojos indican nrMAG específicos presentes en la comunidad central (n = 10).

Entre las CAZimas identificadas, las glucósidos hidrolasas (GH) son una importante familia de enzimas involucradas en la degradación de carbohidratos complejos (Fig. 7A) [94]. Esta diversa familia de enzimas incluye celulasas, hemicelulasas, pectina, inulina y varias enzimas que degradan oligosacáridos y almidón. Según los datos del metatranscriptoma, la celulasa, la hemicelulosa y las enzimas que degradan el almidón mostraron una actividad elevada en KBP y SZBP (Fig. 7B, C). Entre varias diferencias, las actividades de las celulasas (GH2 y GH3), las hemicelulasas (GH43 y GH18) y las enzimas que degradan el almidón (GH97 y GH31) fueron significativamente más altas en KBP y SZBP en comparación con las de MWBP (log2 FC: ≥2; p ≤ 0,05) (Fig. 7B y Tabla complementaria 5). Taxonómicamente, los miembros de los filos Bacteroidota (que representan el 46 % de TPM de GH), Firmicutes G y Firmicutes A (12 % y 7 % de TPM de GH, respectivamente) fueron los contribuyentes dominantes de la actividad de GH. Se ha descubierto que estos filos son los principales degradadores de polisacáridos en muchas comunidades productoras de biogás [77, 95]. Sin embargo, nuestros datos de metatranscriptómica sugirieron que los miembros de otros filos como Actinobacteriota (8% TPM de GH), Chloroflexota (4% TPM de GH) y Spirochaetota (5% TPM de GH) también expresaron enzimas degradadoras de carbohidratos complejos (Fig. 7A) [29, 38]. Una evaluación cuantitativa combinada de los módulos de unión a carbohidratos (CBM) y la actividad de GH reveló que los 30 nrMAG hidrolizados principales se distribuyen en múltiples filos (Fig. 7C).

Se detectaron ocho núcleos nrMAG entre los nrMAG hidrolizantes altamente activos. Estos ocho representaron alrededor del 35% de la actividad total de hidrolizadores superiores (Fig. 7C). Encontramos que UBA1179_sp002340405 (MAG_187_1) y Fermentimonas sp019136875 (MAG_96_1) pertenecen al Clúster I, UBA1402 sp002305085 (MAG_105_3) y Paludibacter sp012519425 (MAG_151_3) al Clúster IV, y SR-FBR-E99 sp0 09881065 (MAG_72_3) y W0P28-013 sp012837685 (MAG_251_2 ) al Grupo VII. (Figs. 6B y 7C). Los miembros de los hidrolizadores de núcleo superior pertenecientes a los Grupos IV e I mostraron las interacciones más extendidas (Fig. 6A). Estos grupos estuvieron directa o indirectamente involucrados a través de IHT y mostraron asociaciones positivas con Methanoculleus bourgensis, Methanoculleus especie 1, Methanobacterium sp012838205 y Methanoculleus sp012797575 (rho de Pearson 0.6–0.9). Sin embargo, el grupo también mostró una correlación negativa con Methanospirillum sp0125200015, Methanothrix sp016706325 y Methanoculleus sp002497965. Los últimos metanógenos hidrogenotróficos y acetótrofos capaces de IFT y DIET coincidieron con el Grupo VII (rho de Pearson < −0.6). En general, las concentraciones de TAN, VOA y TIC se correlacionaron positivamente con las nrMAG hidrolizantes del núcleo más activas en los Grupos I y IV (rho de Pearson > 0,6). Sin embargo, hubo excepciones que involucraron microorganismos pertenecientes al Grupo VII.

Para caracterizar aún más la cadena alimentaria productora de metano, realizamos un análisis funcional de los nrMAG combinando datos de metatranscriptoma y datos de la base de datos KEGG (Fig. 8). El análisis de los módulos KEGG indicó que la vía de la metanogénesis fue la más activa entre todas las vías principales (media = 35 % TPM de todas las vías KEGG). Estudios previos de metagenoma han considerado que la metanogénesis es un "módulo raro" en la comunidad de producción de biogás [18, 29, 38] (Fig. 8A). Es importante tener en cuenta que, si bien la metanogénesis fue de hecho un módulo raro basado en los datos del metagenoma, los datos del transcriptoma sugirieron lo contrario [95,96,97,98]. Considerando esto, los análisis de metatranscriptoma, que cuantifican las actividades biológicas de los microorganismos en ambientes complejos, brindan una representación más precisa de la vida microbiana y la actividad microbiana que ocurre dentro de la comunidad que los estudios metagenómicos.

Un mapa de calor de los módulos KEGG más activos. Se muestran los 30 módulos KEGG principales de las doce muestras basadas en datos metatranscriptómicos (que se muestran en TPM). B Análisis de componentes principales de los datos funcionales del módulo KEGG. Cada símbolo está relacionado con un par específico de PA-muestra. C Genes metanogénicos significativamente diferentes identificados en los cinco metanógenos más activos. Se muestran las diferencias consideradas estadísticamente significativas calculadas por DESeq2 (es decir, con log2 FC > 2,0, p < 0,05). El mapa de calor representa la actividad génica promedio de cada metanógeno en los distintos BP. Los espacios en blanco representan genes que no fueron significativamente diferentes en el metanógeno proporcionado, o el gen indicado está ausente en el nrMAG dado.

Identificamos la oxidación del piruvato, la vía de Embden-Meyerhof y la vía de las pentosas-fosfato como módulos centrales del metabolismo de los carbohidratos. Estas vías se han denominado "módulos centrales" en investigaciones metagenómicas anteriores [29, 38]. Los azúcares, provenientes de la hidrólisis, se pueden convertir en piruvato a través de las vías de Embden-Meyerhof y pentosa-fosfato para producir CO2 y electrones. Además, la vía del acetil-CoA, la biosíntesis de ácidos grasos y la beta-oxidación están activas entre las 30 vías principales relacionadas con la fijación de carbono, como se ha observado previamente en reactores suplementados con estiércol [29]. Este hallazgo fue respaldado por la identificación de numerosos módulos activos asociados con la producción de energía, aminoácidos y cofactores, todos los cuales son esenciales para un ecosistema de generación de biogás que funcione bien. A continuación, descubrimos que KBP y SZBP compartían una composición microbiana y un perfil funcional similares, mientras que los de MWBP parecían (según los módulos KEGG) claramente distintos (Fig. 8B).

Para evaluar los patrones de expresión a nivel de transcripción, se utilizó el análisis de expresión diferencial (ver: "Análisis estadístico"). Detectamos alteraciones en 11 383 genes entre los tres BP utilizando este análisis de alta resolución (log2 FC > 2,0, p ≤ 0,05) (Tabla complementaria 5). Se demostró que KBP y SZBP contienen menos genes expresados ​​​​diferencialmente (DEG) que estos en comparación con MWBP (Fig. 8B y Fig. 2 complementaria). Una investigación exhaustiva de DEG encontró 215 genes involucrados en la metanogénesis. Las actividades de las subunidades alfa, beta y gamma de la metil coenzima M reductasa mostraron los cambios más sustanciales (log2 FC > 10, p < 0,0001). Además, la expresión de genes implicados en la metanogénesis hidrogenotrófica, como la subunidad ion-azufre de la hidrogenasa no reductora F420 y la metilentetrahidrometanopterina deshidrogenasa, mostró diferencias sustanciales (log2 FC > 5, p < 0,001). La acetil-CoA sintetasa demostró variaciones en la expresión de los genes implicados en la metanogénesis acetotrófica (log2 FC > 5, p < 0,001) [99]. La mayoría de las diferentes actividades genéticas en KBP estaban relacionadas con Methanothrix A harundinaceae D (MAG_5_1), mientras que Methanothrix_sp016706325 (MAG_97_2) en MWBP y Methanobacterium sp012838205, Methanoculleus sp12797575 y especies de Methanosarcina (MAG_669_3, _57_1 y _165 _3) en SZBP (Fig. 8C).

En una comunidad compleja productora de biogás, las arqueas metanogénicas utilizan varias rutas metabólicas y conjuntos de genes para producir metano como una forma de obtener energía y compensar su abundancia a través de su actividad. Según investigaciones anteriores, en condiciones de hidrógeno limitado, Methanococcus maripaludis mostró niveles elevados de ARNm para genes que codifican enzimas, incluida la hidrogenasa no reductora F420 y la metilentetrahidrometanopterina deshidrogenasa, lo que resultó en un aumento en su tasa de crecimiento [100]. Se observaron resultados similares en nuestro estudio con el abundante Methanoculleus sp12797575 (MAG_57_1) en SZBP. Estas enzimas demostraron una actividad elevada en este metanógeno hidrogenotrófico perteneciente al Grupo II, que coincidió con los nrMAG hidrolizadores JAAZLA01 sp012799545 ​​y UBA1361 sp002306335 (Fig. 6A). La expresión elevada de formiato deshidrogenasa indica que MAG_57_1 utiliza formiato como fuente alternativa de hidrógeno (Fig. 8C) para compensar su actividad metanogénica. Esta actividad es comparable a las especies mixotróficas de Methanosarcina que se encuentran comúnmente en SZBP (que son capaces de realizar todas las vías metanogénicas; sin embargo, no se identificó ningún representante a nivel de especie en las bases de datos GTDB y Biogas Microbiome; MAG_165_3). Esto está en línea con los hallazgos de observaciones anteriores de que la diversidad metabólica de la comunidad metanogénica es fundamental para la producción eficiente de biogás [74, 75].

En este estudio, reconstruimos nrMAG (genomas ensamblados en metagenomas no redundantes) de alta calidad y realizamos un análisis preciso de metatranscriptomas con la ayuda de un flujo de trabajo de agrupamiento de redes neuronales artificiales en muestras de AD tomadas de reactores de biogás a escala industrial. Aunque los tres BP a escala industrial operaron con materias primas distintas y bien caracterizadas, no observamos diferencias en sus respectivos rendimientos de metano durante el período de observación. La composición del microbioma y los repertorios funcionales de los BP KBP y SZBP eran más similares entre sí que con los de MWBP. Múltiples filos bacterianos fueron identificados como los principales microorganismos hidrolizadores. La correlación significativa entre el microbioma central y los parámetros de fermentación como TAN, VOA y TIC sugiere que la red de interacción en la comunidad microbiana central de AD está influenciada por varios parámetros operativos químicos. Los metanógenos hidrogenotróficos (Archaea: Halobacteriota, Methanobacteriota) fueron dominantes y se correlacionaron positivamente con la presencia de representantes de los filos bacterianos Firmicutes y Bacteroidota, con quienes realizan transferencias entre especies versátiles. También se han encontrado en biomasa agrícola y aguas residuales distintos mecanismos de transferencia de electrones utilizados por metanógenos hidrogenotróficos en AD. Se detectó una especie de arquea clave (Methanothrix sp016706325; MAG_97_2) en la comunidad metanogénica central y probablemente desempeñe un papel clave en la configuración de la estrategia microbiana productora de metano. Nuestro estudio encontró que las arqueas metanogénicas en tres plantas de biogás a escala industrial mantuvieron una actividad general similar a pesar de las diferencias en las condiciones operativas y los parámetros medidos. La presencia de una amplia gama de arqueas metanogénicas en los digestores puede mejorar la resiliencia de la comunidad al ofrecer redundancia y estabilidad funcional, lo que enfatiza el papel crucial de la diversidad metabólica para garantizar una producción eficiente de biogás. Este hallazgo también fue consistente con nuestras mediciones de prueba de BMP. Sin embargo, el presente estudio de caso confirma que quedan importantes lagunas de conocimiento en nuestra comprensión de las actividades y las relaciones entre especies entre los miembros de las comunidades productoras de biogás. Estas brechas se pueden abordar, al menos en parte, mediante un marco que combina el análisis del metagenoma resuelto por el genoma con un enfoque metatranscriptómico paralelo guiado por algoritmos específicos de aprendizaje automático, como modelos específicos de hábitat.

Las secuencias sin procesar del metagenoma y el metatranscriptoma generadas y analizadas durante el estudio actual se depositaron en el NCBI SRA con el número de acceso PRJNA929705. Los nrMAG de alta calidad (compl. >90 % cont. <5 %) se depositan en NCBI SRA con números de acceso de SAMN32989584 a SAMN32989690. Los principales datos generados o analizados para este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Los flujos de trabajo y los scripts R están disponibles del primer autor a pedido razonable.

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Roland Wirth diseñó y realizó los análisis bioinformáticos y escribió el manuscrito. Teur Teur Sally Cheung y Zoltán Bagi realizaron los experimentos y realizaron mediciones analíticas. Prateek Shetty contribuyó a los análisis metaómicos. Kornél L. Kovács y Gergely Maróti diseñaron el estudio, escribieron el manuscrito y discutieron la literatura relevante. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Este estudio ha sido apoyado en parte por los proyectos del Fondo Nacional Húngaro de Investigación, Desarrollo e Innovación (NRDIF): RW, BZ y GM recibieron apoyo de los proyectos PD132145, FK142500, FK123902, FK123899, K143198 y ÚNKP-22-5-SZTE-537 . Este trabajo también fue apoyado por el Programa Lendület (GM) y la Beca Bolyai (WR) de la Academia Húngara de Ciencias (LP2020-5/2020 y BO/00449/22) y por el Programa de Laboratorio Nacional Széchenyi Plan Plus (Laboratorio Nacional de Ciencias del Agua y Seguridad Hídrica, RRF-2.3.1-21-2022-00008). BZ y KLK recibieron soporte de 2020-3.1.2-ZFR-KVG-2020-00009 y 2019-2.1.13-TÉT_IN-2020-00016. Financiamiento de acceso abierto proporcionado por ELKH Biological Research Center.

Instituto de Biología Vegetal, Centro de Investigación Biológica, Szeged, Hungría

Roland Wirth, Prateek Shetty y Gergely Maróti

Departamento de Biotecnología, Universidad de Szeged, Szeged, Hungría

Roland Wirth, Zoltán Bagi, Márk Szuhaj, Teur Teur Sally Cheung y Kornél L. Kovács

Facultad de Ciencias del Agua, Universidad de Servicio Público, Baja, Hungría

Gergely Maroti

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Correspondencia a Gergely Maróti.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Wirth, R., Bagi, Z., Shetty, P. et al. Interacciones entre reinos y estabilidad de los metanógenos revelados por el análisis multiómico guiado por aprendizaje automático de plantas de biogás a escala industrial. ISME J (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01448-3

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Recibido: 08 febrero 2023

Revisado: 23 de mayo de 2023

Aceptado: 26 de mayo de 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01448-3

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