Filtros de muesca de película delgada como plataformas para el procesamiento de imágenes biológicas

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 4494 (2023) Citar este artículo

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Muchas operaciones de procesamiento de imágenes implican la modificación del contenido de frecuencia espacial de las imágenes. Aquí demostramos el filtrado de frecuencia espacial en el plano del objeto utilizando la sensibilidad angular de un filtro de supresión de banda espectral comercial. Se muestra que este enfoque para el procesamiento de imágenes completamente óptico genera imágenes pseudo-3D en tiempo real de muestras biológicas transparentes y de otro tipo, como células de cáncer de cuello uterino humano. Este trabajo demuestra el potencial de los enfoques no interferométricos no locales para el procesamiento de imágenes para usos en la visualización dinámica y la obtención de imágenes de células biológicas sin etiquetas.

Los objetos transparentes, incluida la mayoría de las células biológicas, interactúan débilmente con la luz, lo que genera poco contraste en la microscopía de campo brillante convencional. Sin embargo, las variaciones espaciales en su morfología y propiedades ópticas introducen variaciones de fase locales en la luz transmitida a través de ellos. En el caso más simple, esto se puede caracterizar por una función de transmisión \(O(x,y) \approx O_0 e^{i\varphi (x,y)}\). La amplitud aproximadamente espacialmente invariable \(O_0\) produce una imagen de intensidad sin características \(|O(x, y)|^2 = |O_0|^2\), mientras que la información sobre la forma y el índice de refracción está contenida en la función de fase \ (\varphi(x,y)\). Tales variaciones de fase no pueden ser detectadas directamente por las cámaras convencionales y, por lo tanto, requieren una detección indirecta. Los métodos populares de visualización de fase óptica incluyen imágenes de Schlieren1, así como contraste de fase de Zernike2, campo oscuro3 y microscopía de contraste de interferencia diferencial4. Sin embargo, estos pueden requerir componentes costosos o acceso al plano de Fourier que aumenta la complejidad y el tamaño del sistema. Los métodos digitales incluyen ptychography5,6,7, el uso de la ecuación de transporte de intensidad8,9,10 o algoritmos de recuperación de fase como los algoritmos de Gerchberg-Saxton11 y Fienup12. Sin embargo, estos pueden estar limitados por sus extensos requisitos computacionales.

El procesamiento de imágenes del plano del objeto totalmente óptico ofrece una alternativa no interferométrica y compacta para la visualización de fases. Está habilitado por sistemas ópticos lineales invariantes en el espacio 2D, como películas delgadas13,14, con respuestas angulares que filtran directamente la frecuencia espacial de los campos de ondas15. A diferencia de los métodos computacionales o totalmente ópticos comunes que utilizan la configuración clásica \(4f\)16, evita pérdidas de información de fase óptica, procesamiento posterior que consume energía y configuraciones voluminosas asociadas con el acceso a planos de Fourier. La importancia de los sistemas ópticos compactos para el procesamiento de imágenes en el plano del objeto totalmente óptico está motivada por el potencial de integración en dispositivos portátiles. Esto puede tener aplicaciones tan diversas como diagnósticos móviles, monitoreo ambiental y sensores remotos.

Para explicar cómo un dispositivo que exhibe dispersión angular puede realizar el procesamiento de imágenes, ignoramos cualquier efecto de polarización por simplicidad. En este caso, el impacto del filtrado de Fourier en el plano del objeto en el espectro de frecuencia espacial del campo se puede describir mediante una función de transferencia óptica \({\mathscr {H}}(k_x, k_y)\)17. Al tomar el eje \(z\) como el eje óptico, \(k_{x}\) y \(k_{y}\) denotan las componentes transversales de frecuencia espacial del vector de onda \(\vec {k} = (k_x, k_y, k_z)\) y \(k_z = \sqrt{|\vec {k}|^2 - k_x^2 - k_y^2}\). La función de transferencia relaciona la salida procesada con el campo de entrada por el teorema de convolución,

donde \({\mathscr {F}}\) denota la transformada de Fourier, \(E\) representa cualquier componente del campo eléctrico y \(\tilde{E}_{\text {in}} = {\mathscr { F}}\left\{ E_{ \text {in} } \right\}\). Por ejemplo, los filtros de paso alto bloquean las frecuencias espaciales bajas para eliminar los componentes de campo no dispersos para la detección de bordes18, que es fundamental para la compresión de datos19 y la visión artificial20,21. Una subclase notable es la de las funciones de transferencia óptica lineal, es decir, \({\mathscr {H}} \propto k_x\) o \({\mathscr {H}} \propto k_y\), que pueden calcular las derivadas espaciales , hasta una constante multiplicativa, de un campo de onda entrante a lo largo de la dirección \(x\) o \(y\), respectivamente. Como resultado, los gradientes de fase se pueden asignar a variaciones de intensidad para permitir la visualización de fase en el caso de muestras transparentes13. La influencia de la polarización se puede incorporar a este enfoque utilizando un tensor diádico de función de transferencia \(2 \times 2\).

La sensibilidad angular proporciona el mecanismo para el procesamiento de imágenes a través de la correspondencia entre ángulos de incidencia y frecuencias espaciales. Esto viene dado por representar los componentes de frecuencia espacial en coordenadas esféricas15,

donde \(k_0=|\vec {k}|\) es el número de onda, mientras que \((\theta , \phi )\) son los ángulos de propagación polar y azimutal de las ondas planas con respecto a \(z\)- eje. Dado que las funciones de transferencia óptica representan respuestas de ondas planas en \(k\)-espacio, y que la luz puede descomponerse en ondas planas ponderadas mediante la transformada espacial de Fourier15,22, se deduce que los dispositivos que exhiben transmisión dispersiva angular son capaces de procesamiento de imágenes.

Recientemente, los dispositivos metaópticos han atraído una atención considerable como procesadores de imagen ultracompactos23. Por ejemplo, Zhou et al.24 emplearon cristales fotónicos para la detección de bordes de muestras orgánicas, mientras que Wesemann et al.25 obtuvieron imágenes de contraste de fase de células cancerosas humanas utilizando una rejilla de guía de onda resonante. Otros enfoques han implicado resonancias Mie26,27 o Fano28, efectos de acoplamiento espín-órbita fotónicos29,30 y estados ligados en el continuo31. Con este creciente interés en la metaóptica, es oportuno considerar otros elementos ópticos capaces de desempeñar un papel equivalente. Trabajos anteriores han investigado varias estructuras para la detección de bordes, como filtros de holograma de volumen32, Fabry-Pérot etalons33, filtros de interferencia desafinados34,35, moduladores acústico-ópticos36 y rejillas37,38,39. Con la excepción de los métodos de contraste de fase del plano de Fourier, la aparición de métodos digitales exitosos para el procesamiento de imágenes frenó el progreso en todas las técnicas ópticas. Sin embargo, esto se está revisando a la luz del rápido aumento de los datos que se generan y su impacto asociado en el consumo de energía y las tasas de procesamiento.

Aquí demostramos el uso de un filtro de muesca espectral de película delgada disponible comercialmente aplicado a la obtención de imágenes de contraste de fase de muestras transparentes. Los filtros de muesca son filtros de parada de banda comúnmente empleados en varios tipos de espectroscopia para eliminar frecuencias temporales en un rango específico40,41. Se muestra que la dispersión angular de la banda de rechazo del filtro produce un filtro de frecuencia espacial de paso alto en la longitud de onda operativa. El enfoque presentado aquí se basa en la introducción de un sesgo de fase inclinando el filtro con respecto al eje óptico para producir imágenes pseudo tridimensionales similares a las obtenidas en la microscopía de contraste de interferencia diferencial. El contraste generado está determinado por el eje y el ángulo de rotación, mientras que el campo de visión y la resolución de las imágenes están determinados por las especificaciones del sistema óptico. Demostramos imágenes de contraste mejoradas de campos de ondas introducidos por un modulador de luz espacial y muestras biológicas sin teñir. Nuestros resultados confirman la obtención de imágenes instantáneas de contraste de fase sin procesamiento posterior, lo que permite obtener imágenes directas con una cámara o con el ojo. El método proporciona un enfoque totalmente óptico alternativo para el procesamiento de imágenes biológicas y de otro tipo con capacidades de imagen comparables a los métodos convencionales, pero utilizando un filtro de parada de banda espectral disponible en el mercado. Su disponibilidad y la simplicidad del enfoque propuesto lo convierten en una técnica rápida y útil para obtener información sobre imágenes de contraste de fase dentro de cualquier sistema de imágenes. Por lo tanto, tiene potencial para desarrollos en visión artificial, imágenes biológicas y monitoreo dinámico.

El dispositivo investigado aquí es un filtro de muesca obtenido comercialmente (Thorlabs NF633-25), que tiene una longitud de onda operativa central especificada de 633 nm y un ancho de banda de 25 nm en incidencia normal. Los espectros de transmisión del dispositivo en función del ángulo de incidencia se midieron experimentalmente utilizando la configuración de la Fig. 1, con detalles proporcionados en la sección "Métodos". Se pasó luz blanca colimada de una lámpara halógena a través del filtro de muesca en diferentes ángulos de incidencia y se enfocó en un espectrómetro. Los resultados (Fig. 2a) obtenidos utilizando luz polarizada circularmente son consistentes con las especificaciones del fabricante. Mientras tanto, los resultados para \(p\)- y \(s\)-luz polarizada se dan en la información complementaria (§S1.1). Estos resultados confirman el rechazo de banda en la longitud de onda operativa con un ancho de banda de aproximadamente 25 nm, así como el desplazamiento hacia el azul de la región de parada de banda con un ángulo de incidencia creciente. Observando la correspondencia entre los ángulos de incidencia y las frecuencias espaciales, se encuentra que el filtro de muesca suprime las frecuencias espaciales bajas asociadas con ángulos de incidencia casi normales en la longitud de onda de parada de banda.

La configuración experimental utilizada para capturar los espectros de transmisión del filtro de muesca. Aquí, LP y QWP denotan polarizador lineal y placa de cuarto de onda, respectivamente. El esquema no está a escala.

Las funciones de transferencia de modulación \(\vert{\mathscr {H}}(k_x, k_y)\vert\) para \(p\)-, \(s\)- y las polarizaciones circulares se mapearon a partir de los espectros de transmisión medidos en la Fig. 2a. Los perfiles de línea a lo largo de \(k_y=0\) (Fig. 2b) en la longitud de onda de parada de banda exhiben un comportamiento de paso alto aproximadamente insensible a la polarización con una zona de supresión del rango de apertura numérica (NA) \(0.20\). Esto es una consecuencia del desplazamiento hacia el azul de la longitud de onda de parada de banda con el aumento del ángulo de incidencia. Una característica significativa del dispositivo es la región de dependencia lineal aproximada de \(k_x\) desde cero hasta una transmisión cercana a la unidad más allá de la zona de supresión. Esto está respaldado por el ajuste lineal (Fig. 2c) de la función de transferencia de modulación para polarización circular de \(k_x/k_0 \approx 0.20\) a \(0.30\), representada por la relación \(A k_x/k_0 + B\ ). La función polyfit y la caja de herramientas de ajuste de curvas en MATLAB se utilizaron para obtener los parámetros de ajuste y sus intervalos de error como \(A = 5.9 \pm 0.83\) y \(B = -0.97 \pm 0.22\). Girar el filtro \({12}^\circ\) alrededor de una línea perpendicular al eje óptico cambia la operación a \(k_x/k_0 \approx \pm 0.20\) para acceder a esta región, denominada aquí como zona de contraste. Esta característica del dispositivo permite la visualización de variaciones de fase en campos de ondas en forma de cambios de intensidad.

La respuesta de transmisión experimental del filtro obtenida al rotar incrementalmente el filtro (a). La línea discontinua en (a) indica la longitud de onda de parada de banda de 633 nm y las flechas indican el ancho de la región de parada de banda en incidencia normal. El módulo cuadrado de la función de transferencia de modulación a lo largo de \(k_y=0\) para varias polarizaciones (b) se compara con los datos proporcionados por el fabricante. El ajuste lineal de la función de transferencia de modulación para polarización circular en la zona de contraste se da en (c).

Para explicar cómo el filtro de muesca genera contraste relacionado con los gradientes de fase en un campo de ondas, considere ondas planas monocromáticas normalmente incidentes \(E_s(x,y,z)\) de longitud de onda \(\lambda\) y vector de onda \(\vec {k}\) propagándose a lo largo del eje z. La fuente ilumina una muestra transparente con una función de transmisión \(O(x, y) = O_0 e^{i \varphi (x, y)}\). Su visualización requiere resaltar los cambios de fase impartidos a la luz transmitida a través de él, que se puede modelar como

donde hemos ignorado los efectos vectoriales aquí por simplicidad. Dada la siguiente propiedad para la transformada de Fourier de derivadas,

luego una función de transferencia óptica lineal y la ecuación. (3) sustituido en la ecuación. (1) produce la derivada espacial de \(O(x,y)\),

Esto genera imágenes de intensidad proporcional a \(| \parcial \varphi (x,y)/\parcial x |^2\) o \(| \parcial \varphi (x,y)/\parcial y |^2\), con contraste creado en regiones donde la fase varía a lo largo de la dirección de diferenciación.

El filtro de muesca produce aproximadamente la derivada espacial alrededor de un desplazamiento angular dentro de la zona de contraste. Operar cerca del borde de la zona de contraste en un ángulo de rotación de aproximadamente \({12}^\circ\) elimina los componentes de baja frecuencia espacial, dejando solo gradientes de fase relativamente grandes correspondientes a los bordes de las imágenes, como se muestra en la información complementaria (§ S1.2). Por lo tanto, las imágenes producidas serían comparables a las obtenidas en imágenes de Schlieren y microscopía de campo oscuro. La operación de desplazamiento dentro de la zona de contraste en un ángulo de rotación de \({14}^\circ\), correspondiente a una frecuencia espacial normalizada de \(k_x/k_0 \approx 0.24\), conserva algo del campo de fondo que permite la discriminación entre gradientes de fase positivos y negativos. Estos se manifiestan como diferentes niveles de escala de grises por encima o por debajo del origen del espacio \(k\) desplazado, respectivamente. Por lo tanto, operar dentro de la zona de contraste permite la visualización de la fase mediante el mapeo de las variaciones de fase a los cambios de intensidad. La presencia de algunos componentes no dispersos retiene un fondo de intensidad distinto de cero que lo distingue de las imágenes de campo oscuro. En cambio, crea un contraste pseudo-tridimensional, similar al que se ve en la microscopía de contraste de interferencia diferencial, a través de información sobre el signo del gradiente. Además, el tipo de contraste se puede controlar cambiando el eje de rotación para visualizar gradientes de fase a lo largo de diferentes direcciones. Estos forman los fundamentos clave de este artículo para describir la capacidad de los filtros de muesca para la visualización de fase.

El procesamiento de imágenes totalmente óptico se realizó experimentalmente en varias muestras con el filtro de muesca utilizando luz láser polarizada circularmente de 635 nm. La detección de bordes de muestras de amplitud se demostró por primera vez en un objetivo de prueba de resolución de la USAF, con detalles y resultados proporcionados en la información complementaria (§S1.2). A continuación, se realizaron imágenes de contraste de fase utilizando la configuración de la figura 3, que se detalla en la sección "Métodos". Un modulador de luz espacial controlado por computadora, que comprende 1920 \(\times\) 1080 píxeles de cristal líquido de \({8}\,\upmu \hbox {m}\) pitch, perfiles de fase emulados de glóbulos rojos humanos (Fig. 4a). Estos fueron modelados utilizando las propiedades ópticas proporcionadas en Ref.42. La luz colimada reflejada por el modulador de luz espacial se reflejaba en el filtro de muesca, que se giraba dentro del plano focal entre los objetivos del microscopio emparejados para garantizar el funcionamiento dentro de la zona de contraste del dispositivo. Las imágenes transmitidas fueron luego capturadas por una cámara. El campo de visión del sistema fue establecido por la apertura del modulador de luz espacial y los componentes ópticos.

La configuración experimental para el procesamiento de imágenes con un modulador de luz espacial (SLM), donde L y MO denotan lentes y objetivos de microscopio, respectivamente. El esquema no está a escala.

Los resultados se presentan en la Fig. 4b-e, donde se comparan imágenes simuladas y experimentales. Una imagen de control experimental (Fig. 4b) muestra un contraste deficiente, lo que hace que el objeto sea prácticamente invisible como se esperaba para las muestras de absorción débil. Esto se obtuvo capturando la imagen en ausencia del filtro de muesca usando la configuración en la Fig. 3. Se obtuvo una imagen de fase simulada (Fig. 4c) usando simulaciones numéricas realizadas en Python, que se detalla en la sección "Métodos". La imagen de fase experimental correspondiente (Fig. 4d) se obtuvo utilizando el filtro de muesca girado en la configuración de la Fig. 3. Tanto en el caso simulado como en el experimental, el filtro de muesca se giró en un ángulo de \({14}^\circ \) para acceder a la zona de contraste. Estos conservaron algunas contribuciones no dispersas que son evidentes a partir de sus fondos de intensidad distinta de cero. En ambos casos, las regiones donde está presente un cambio de fase, es decir, \(\nabla \varphi (x,y) \ne 0\), se revelan con un contraste de intensidad que surge de modulaciones de fase que de otro modo serían invisibles.

El procesamiento de imágenes se realizó en un glóbulo rojo transparente (a) emulado por un modulador de luz espacial con una excursión de fase de \(6\pi /5\). En (b) se proporciona una imagen de control experimental obtenida en ausencia del filtro de muesca, mientras que las imágenes de fase simuladas (c) y experimentales (d) producidas por el filtro de muesca demuestran la visualización de fase. Las imágenes de intensidad (b)–(d) se normalizan a sus píxeles más brillantes, mientras que los perfiles de línea a lo largo de las líneas discontinuas que se muestran en (a), (c) y (d) se dan en (e).

La resolución en micrómetros, indicada por las barras de escala en las imágenes de la Fig. 4a-d, fue determinada por el sistema óptico. Las imágenes de fase resultantes además poseían la capacidad de distinguir entre gradientes de fase positivos y negativos, lo que lleva a la aparición de un contraste de fase pseudo-tridimensional. Además, los perfiles de línea (Fig. 4e) exhiben variaciones de intensidad asociadas con la variación de fase introducida en el campo por la muestra. También se pueden ver algunos artefactos de intensidad, como los que surgen de las variaciones de amplitud en el campo y los artefactos de timbre asociados con el fenómeno de Gibbs que rodean la muestra.

Para ilustrar aplicaciones potenciales, se realizó microscopía de contraste de fase en muestras biológicas con contraste de amplitud débil. Esto se logró utilizando una configuración de microscopio invertido que se muestra en la Fig. 5a y se describe en la sección "Métodos". Se utilizó como muestra una línea celular (HeLa) derivada de cáncer de cuello uterino humano con los pasos de preparación descritos en la sección "Métodos". Su imagen de campo brillante (Fig. 5b) obtenida en ausencia del filtro de muesca muestra un contraste deficiente, con poco o ningún detalle sobre las características celulares. Sin embargo, colocar el filtro de muesca inmediatamente debajo de la muestra permitió la visualización de las variaciones de fase cuando se iluminó con luz láser de 635 nm en un ángulo de incidencia de \({14}^\circ\). La imagen de contraste de fase (Fig. 5c) obtenida dentro de la zona de contraste contiene detalles morfológicos ausentes en la imagen de campo brillante correspondiente, como los resaltados dentro de los círculos discontinuos. El contraste de fase producido mejora significativamente en comparación con la imagen de campo claro de contraste relativamente bajo. Las desviaciones del espesor celular y del índice de refracción local se acentúan para discriminar las células de su fondo.

La proyección de imagen de fase biológica se realizó utilizando el esquema experimental en (a). La línea discontinua representa las células HeLa dentro de una placa de Petri y el esquema no está a escala. En (b) se proporciona una imagen de campo brillante de las células HeLa obtenidas sin el filtro de muesca. La imagen de contraste de fase correspondiente obtenida usando el filtro se da en (c) y una imagen de contraste de interferencia diferencial en (d). Los círculos discontinuos que se muestran en (b)–(d) resaltan las regiones donde el contraste se mejoró significativamente con fines comparativos.

Como línea de base para la comparación, se obtuvo una imagen de contraste de interferencia diferencial convencional de las mismas regiones de las células usando la configuración descrita en la sección "Métodos". La imagen resultante (Fig. 5d) también muestra un contraste de fase significativo con respecto a la imagen de campo claro (Fig. 5a). Se muestra que la calidad de la imagen es similar a la imagen asociada obtenida con el filtro de muesca (Fig. 5b). Además, ambas imágenes se tomaron en una configuración de microscopio, cuya resolución estaba determinada por sus componentes ópticos subyacentes. La resolución micrométrica se obtuvo según lo indicado por las barras de escala en las imágenes. Como resultado, las características del orden de un micrómetro fueron resueltas por el sistema y reveladas por el filtro de muesca.

Inspirados por el reciente aumento en el interés por las imágenes metaópticas, estos resultados representan la primera demostración del procesamiento de imágenes biológicas utilizando un filtro de muesca disponible en el mercado. El contenido de frecuencia espacial de las imágenes fue alterado directamente por el dispositivo en el plano del objeto sin necesidad de acceder al plano de Fourier. La función de transferencia exhibió el comportamiento requerido para el filtrado de paso alto que permite la detección de bordes, además de regiones aproximadamente lineales que permiten la visualización de fases a través de la diferenciación espacial. La rotación del filtro permitió el acceso a estos regímenes para compensar el origen de Fourier en el espacio \(k\).

El contraste obtenido en las imágenes se mejoró significativamente en comparación con las imágenes asociadas sin el filtro de muesca. Las regiones de variación de fase correspondieron a modulaciones de intensidad en la imagen filtrada. La calidad de las imágenes fue competitiva con las obtenidas en microscopía de contraste de interferencia diferencial. Este último utiliza efectos de interferencia para generar un contraste pseudo-tridimensional en imágenes a lo largo de la orientación de un prisma de Wollaston. Por otro lado, el filtro de muesca generó un contraste comparable determinado por la dirección de rotación sin componentes relativamente costosos o voluminosos. La microscopía de contraste de fase Zernike visualiza de manera similar la fase de los campos de ondas a través del filtrado de frecuencia espacial. Sin embargo, este método del plano de Fourier no puede distinguir entre gradientes de fase positivos y negativos de campos de ondas a diferencia del filtro de muesca. Además, también se producen artefactos en las imágenes si los gradientes de fase son demasiado fuertes. En el caso del filtro de muesca, los gradientes de fase se desplazan fuera de la zona de contraste si son demasiado fuertes y, por lo tanto, no aparecen en la imagen. Sin embargo, pueden surgir artefactos debido al grosor del filtro.

Se mostró en la información complementaria (§S1.2) que el filtro de muesca era capaz de producir imágenes similares a las obtenidas en la imagen de Schlieren operando cerca del borde de la zona de contraste. El método de Schlieren consiste en bloquear las frecuencias espaciales positivas o negativas de una imagen. De manera similar, el filtro de muesca suprime las frecuencias espaciales por debajo del origen del espacio \(k\) desplazado cerca del borde de la zona de contraste, mientras que las de arriba se transmiten, lo que corresponde aproximadamente al método de Schlieren. Además, operar dentro de la zona de supresión conduciría a una fuerte supresión de la transmisión de la luz a través del filtro de muesca, asociado con la exclusión de frecuencias espaciales bajas como en la microscopía de campo oscuro. Esto produciría imágenes de campo oscuro de muestras transparentes que mejoran las características de fuerte variación de fase, como sus bordes, sobre un fondo oscuro. Como resultado, los filtros de muesca comerciales ofrecen una alternativa relativamente rentable y fácilmente disponible para la visualización de fase no interferométrica a través del procesamiento de imágenes sin equipos costosos adicionales. Son capaces de producir imágenes de calidad y contraste competitivos en comparación con otros métodos de visualización de fase, lo que es particularmente útil en los casos en que no están disponibles o son demasiado costosos. La resolución y el campo de visión de las imágenes obtenidas con el filtro están limitados únicamente por el sistema óptico en el que se utilizan.

Aunque la región de parada de banda estaba limitada dentro de la banda visible, se han diseñado varios filtros con cobertura en todo el espectro electromagnético. Por ejemplo, Yuan et al.43 presentaron un filtro fotónico utilizable en la banda de absorción del gas acetileno. Otros incluyen terahercios44, infrarrojos45, microondas46,47 y filtros ultravioleta comerciales. Estos tienen potencial para la generación de imágenes de fase en todo el espectro utilizando los métodos descritos en este documento, con aplicaciones en la visión artificial y la generación de imágenes biológicas más allá del rango visible. El monitoreo biológico en vivo es posible con el filtro de muesca que revela dinámicamente la dinámica estructural de los especímenes a través de sus variaciones de fase utilizando los sensores de imágenes existentes. Otras aplicaciones incluyen monitoreo ambiental e integración en sensores convencionales portátiles para formar detectores sensibles a la fase. La incorporación de filtros de muesca en sus planos de detección introduciría selectividad de frecuencia espacial y variaciones de fase en dispositivos basados en la intensidad, que de otro modo serían indiscriminados.

Aunque el contraste de fase fue producido por el filtro de muesca, su comportamiento en la zona de contraste no fue perfectamente lineal. Además, su apertura numérica restringida limita el rango de muestras a las que podría aplicarse. El amplio rango angular de la zona de supresión también restringe el contraste a características suficientemente nítidas. No solo el rango de muestras es limitado, sino que también requiere la rotación del filtro de muesca. Finalmente, el modelo teórico y numérico presentado aquí no incluyó el espesor del filtro de muesca no despreciable, que puede introducir perturbaciones en la trayectoria del haz. Esto puede dar lugar a la aparición de aberraciones como las de las imágenes mejoradas de borde en la información complementaria (§S1.2). Sin embargo, el éxito de los experimentos realizados aquí brinda la confianza de que los filtros de muesca se pueden usar como una alternativa a los métodos de imágenes de contraste de fase existentes. Además, se podrían desarrollar dispositivos de película delgada personalizados con espesores reducidos para minimizar las aberraciones y adaptar la función de transferencia.

En conclusión, este artículo ha demostrado el procesamiento de imágenes en el plano del objeto, completamente óptico y en tiempo real utilizando un filtro de muesca espectral comercial. Las mediciones espectroscópicas verificaron el rechazo de banda de dispersión de ángulo necesario para el filtrado de frecuencia espacial de paso alto y la obtención de imágenes de contraste de fase. La detección de bordes se pudo realizar a través de la zona de supresión donde se eliminaron los componentes de campo no dispersos. Mientras tanto, la compensación de la función de transferencia a regiones aproximadamente lineales dentro de la zona de contraste produjo imágenes de contraste de fase comparables a las obtenidas en la microscopía de contraste de interferencia diferencial. El filtro visualizó muestras biológicas sin teñir, incluida una línea celular derivada de cáncer de cuello uterino humano, que imponen modulaciones de fase que de otro modo serían invisibles. Por lo tanto, los filtros de muesca ofrecen una alternativa no interferométrica y lista para usar para la visualización de fase instantánea que puede desempeñar un papel equivalente a otros métodos de generación de imágenes de fase. Esto tiene implicaciones significativas en la obtención de imágenes biomédicas sin etiquetas48, incluidos los diagnósticos médicos, el crecimiento de microorganismos no invasivos y la monitorización dinámica. Los resultados abren posibilidades de desarrollo para extenderse más allá de la banda visible y construir cámaras sensibles a la frecuencia espacial monolíticas para su comercialización.

Las simulaciones numéricas se realizaron en Python 3.9.549 implementando la ecuación. (1) con la función de transferencia del filtro de muesca. La función de transferencia de modulación medida experimentalmente se combinó con la respuesta de fase interpolada proporcionada por el fabricante para modelar la respuesta óptica del filtro de muesca. El filtro de muesca (Thorlabs NF633-25) utilizado en este artículo tenía un grosor de 3,5 mm y estaba compuesto por películas delgadas de pentóxido de tantalio (Ta\(_2\)O\(_5\)) y dióxido de silicio (SiO\(_2\)) en una sustrato de cuarzo fundido.

La luz blanca de una lámpara halógena acoplada a fibra (Thorlabs SM600) (Ocean Insight HL-2000-FHSA) se colimó usando un objetivo de microscopio (Nikon U Plan FL 20x/0.15NA). Esta luz fue polarizada por un polarizador lineal (Thorlabs LPVIS050-MP) para producir \(p\)- o \(s\)-luz polarizada. La luz polarizada circularmente se produjo mediante la introducción de una placa de un cuarto de onda adicional (Thorlabs AQWP05M-600) antes de iluminar el filtro de muesca. Una lente (Thorlabs LA1068-A, \(f={75}\,\hbox {mm}\)) enfocó la luz transmitida en un espectrómetro de fibra acoplada (Thorlabs M15L01) (Ocean Insight QE6500). Se realizaron mediciones de los espectros de transmisión para ángulos de incidencia que van desde \({-30}^\circ\) a \({+30}^\circ\) rotando gradualmente el filtro por \({2}^\circ \).

La luz láser de 635 nm acoplada a fibra (Thorlabs SM600) (Thorlabs S1FC635) fue colimada por un objetivo de microscopio (Nikon LU Plan 5x/0.15NA) y dos lentes (Thorlabs LA1027-A \(f={75}\,\hbox { mm}\) y LA1509-A \(f={100}\,\hbox {mm}\)). Un polarizador lineal (Thorlabs LPVIS050-MP) aseguró que la luz polarizada linealmente iluminara un modulador de luz espacial reflectante (Holoeye Pluto-2.1-VIS-001 LCOS-SLM). Programó perfiles de fase de glóbulos rojos humanos con una excursión de fase de \(6\pi /5\). La luz reflejada por el SLM pasó a través de una placa de cuarto de onda (Thorlabs AQWP05M-600) para convertirla en polarización circular. Una lente (Thorlabs LA1433-A \(f={150}\,\hbox {mm}\)) y un objetivo de microscopio (Olympus Plan N 20x/0.4NA) desmagnificaron la imagen en el filtro de muesca en su plano focal. Este último fue rotado longitudinalmente por \({14}^\circ\) usando una montura de rotación para acceder a la zona de contraste. Un objetivo de microscopio (Olympus Plan N 20x/0.4NA) y una lente (Thorlabs LA1131-A \(f={50}\,\hbox {mm}\)) volvieron a ampliar y enfocaron la imagen filtrada en una cámara (Thorlabs DCC1645C ).

La microscopía de campo claro se realizó usando luz blanca de un microscopio invertido (Nikon Ti-80i) sin el filtro de muesca. Luego, la fuente de iluminación se reemplazó por una luz láser de 635 nm acoplada a fibra (Thorlabs SM600) (Thorlabs S1FC635) colimada por un objetivo (Olympus A4 4x/0.1NA) y un polarizador lineal (Thorlabs LPVISC100-MP2) y placa de cuarto de onda (Thorlabs AQWP05M-600) produjo luz polarizada circularmente. Estos componentes ópticos estaban contenidos dentro de una jaula óptica montada en una platina XYZ para variar el ángulo de incidencia. El filtro de muesca se colocó inmediatamente debajo de la muestra en la platina del microscopio para realizar la microscopía de contraste de fase. Un objetivo de microscopio (Nikon LU Plan 50x/LWD) recogió la luz filtrada en una cámara (Andor Zyla sCMOS 4.2P). Finalmente, se obtuvo una imagen de contraste de interferencia diferencial utilizando un microscopio (Olympus BX60) con un objetivo de microscopio (Olympus Plan N 20x/0.4NA).

Las células HeLa fueron proporcionadas por el laboratorio Paul Gleeson del Departamento de Bioquímica y Farmacología y el Instituto Bio21 de la Universidad de Melbourne. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Lonza) complementado con suero de crecimiento bovino inactivado por calor al 10 % (Gibco), 1x Pen-Strep (Lonza) a \({37}^\circ \hbox {C}\ ) con 5% de dióxido de carbono. Las células se colocaron en placas 24 h antes de la fijación en platos con fondo de vidrio de 35 mm, antes de fijarse con paraformaldehído al 4 % durante 15 min a temperatura ambiente y lavarse 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores agradecen al laboratorio de Paul Gleeson por obtener las células HeLa y a Thorlabs por proporcionar datos útiles sobre las especificaciones del dispositivo. SBS también agradece a Kenneth B. Crozier por sus útiles debates.

Esta investigación fue financiada por el gobierno australiano a través de la subvención del Centro de Excelencia del Consejo Australiano de Investigación (CE200100010). SBS también reconoce el apoyo de la Beca Ernst & Grace Matthaei y la Beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia.

Los siguientes autores contribuyeron por igual: Shaban B. Sulejman y Niken Priscilla.

Centro de Excelencia ARC para Sistemas Metaópticos Transformativos, Facultad de Física, Universidad de Melbourne, Melbourne, VIC, 3010, Australia

Shaban B. Sulejman, Niken Priscilla, Luke Wesemann, Wendy SL Lee, Timothy J. Davis y Ann Roberts

Centro de Excelencia ARC para Sistemas Metaópticos Transformativos, Departamento de Ingeniería Eléctrica y Electrónica, Universidad de Melbourne, Melbourne, VIC, 3010, Australia

wendy sl lee

Escuela de Física, Universidad de Melbourne, Melbourne, VIC, 3010, Australia

Jieqiong Lou y Elizabeth Hinde

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

SBS y AR concibieron y supervisaron el proyecto sobre la idea de usar filtros de muesca propuestos por TJDSBS realizaron el trabajo teórico y numérico, junto con los experimentos de detección de bordes con el apoyo de ARNP, LW y WSLL realizaron las mediciones espectrales y los experimentos de imágenes de fase con el apoyo de SBSJL y EH recuperaron y prepararon las células HeLa. SBS procesó los datos y preparó el manuscrito con el apoyo de LW, mientras que todos los autores proporcionaron comentarios.

Correspondencia a Shaban B. Sulejman.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Sulejman, SB, Priscilla, N., Wesemann, L. et al. Filtros de muesca de película delgada como plataformas para el procesamiento de imágenes biológicas. Informe científico 13, 4494 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31528-5

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Recibido: 18 noviembre 2022

Aceptado: 14 de marzo de 2023

Publicado: 18 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31528-5

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