Complejidad inesperada de la amoníaco monooxigenasa en arqueas

The ISME Journal volumen 17, páginas 588–599 (2023) Citar este artículo

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Una corrección de este artículo se publicó el 28 de abril de 2023.

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La oxidación del amoníaco, como primer paso de la nitrificación, constituye un proceso crítico en el ciclo global del nitrógeno. Sin embargo, falta un conocimiento fundamental de su enzima clave, la amoníaco monooxigenasa dependiente de cobre, en particular para las arqueas oxidantes de amoníaco (AOA), abundantes en el medio ambiente. Aquí, la estructura de la enzima se investiga mediante electroforesis en gel nativo azul y proteómica a partir de complejos de membrana nativos de dos AOA. Además de las subunidades AmoABC conocidas y la AmoX prevista anteriormente, se identificaron dos nuevas subunidades proteicas, AmoY y AmoZ. Son exclusivos de AOA, altamente conservados y co-regulados, y sus genes están vinculados a otros genes de subunidades AMO en genomas AOA optimizados. Los enfoques de modelado y reticulación en gel respaldan una estructura de protómero general similar a la metano monooxigenasa de partículas bacterianas distantes, pero también revelan diferencias claras en los dominios extracelulares de la enzima. Estos datos abren vías para más estudios de estructura y función de este complejo de nitrificación ecológicamente importante.

La nitrificación, la conversión de amonio en nitrato, es un paso crucial en el ciclo global del nitrógeno realizado únicamente por microorganismos. El proceso ha atraído una atención particular debido a su relevancia agrícola y ambiental. El primer paso de la nitrificación, que limita la velocidad [1], es la oxidación del amoníaco a través de la monooxigenasa (AMO) del complejo de proteína de membrana integral [2, 3]. Si bien las bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) se descubrieron por primera vez hace más de 125 años [4] y se han estudiado ampliamente, este proceso biológico también se detectó en el dominio de las arqueas en los últimos 20 años [5,6,7]. Las arqueas oxidantes de amoníaco (AOA, por sus siglas en inglés) han ganado una amplia atención ya que están muy extendidas en la naturaleza y son más abundantes que sus contrapartes bacterianas en la mayoría de los ambientes terrestres y marinos, lo que indica un papel importante en el ciclo del nitrógeno [8,9,10,11,12,13 ,14]. Sin embargo, su metabolismo central de nitrógeno y carbono es distinto del de AOB [15,16,17,18]. En particular, las subunidades del complejo AMO muestran solo alrededor del 40 % de identidad con las de las bacterias [19] y las proteínas de las arqueas que catalizan el segundo paso en la oxidación del amoníaco, es decir, la conversión de hidroxilamina en nitrito, aún se desconocen [19,20,21]. . Estas diferencias implican una diferenciación funcional importante en sus roles ambientales que aún no se han desentrañado.

Debido a la dificultad de cultivar organismos nitrificantes y los problemas inherentes con el aislamiento de proteínas de membrana, no se han llevado a cabo con éxito estudios estructurales para ningún complejo AMO, bacteriano o arqueal. Esto es cierto para la mayoría de las diversas enzimas de la familia de proteínas CuMMO (monooxigenasa de membrana dependiente de cobre), con algunas excepciones notables. Las estructuras cristalinas [22,23,24,25,26] y las estructuras crio-EM [27, 28] de partículas de metano monooxigenasa (pMMO) de cinco metanótrofos han confirmado consistentemente un protómero de tres polipéptidos (subunidades -A, -B y - C) dispuestos en un trímero de configuración α3β3γ3 con al menos dos sitios metálicos conservados en cada protómero. Aun así, la elucidación del sitio activo sigue siendo ambigua. Primero se propuso residir en la subunidad PmoB de pMMO [29]. Más recientemente, un análisis crio-EM respalda que el sitio activo está coordinado principalmente por PmoA [27], mientras que la conservación de aminoácidos difiere en Verrucomicrobia [30], un análisis espectroscópico reciente [31] y la mutagénesis de una monooxigenasa de hidrocarburo [32], sugieren su localización en la subunidad PmoC.

Aunque no se ha determinado experimentalmente ninguna estructura de AMO, el modelado de homología para el AMO de la bacteria Nitrosomonas europaea utilizando pMMO como plantilla apoyó una estructura homotrimérica, así como la conservación de los sitios de cobre CuB y CuC [33]. El complejo Archaeal AMO es la proteína CuMMO más lejanamente relacionada [34, 35] y hasta ahora se sabe muy poco sobre su estructura o función. Basándose solo en la metagenómica comparativa, se ha sugerido que una subunidad adicional podría estar presente en el complejo, denominada AmoX [15, 36].

Para obtener información sobre la arquitectura general del complejo AMO archaeal, se analizaron bioquímicamente fracciones de proteínas de membrana del AOA del suelo bien caracterizado, Nitrososphaera viennensis, mediante electroforesis en gel nativo, espectrometría de masas y reticulación química. Además de las tres proteínas AmoABC conocidas, se identificaron tres subunidades potenciales adicionales y una de las seis proteínas AmoC previstas en N. viennensis se reconoció como el homólogo principal en el complejo proteico. Además, la composición general de subunidades del complejo AMO se confirmó en el AOA termofílico Nitrosocaldus cavascurensis, relacionado de forma distante.

Nitrososphaera viennensis se cultivó como cultivo continuo en biorreactores de 2 L (Eppendorf) llenos con 1,5 L de medio de agua dulce (FWM) [37, 38] con solución de oligoelementos modificada [5], FeNaEDTA 7,5 µM, NH4Cl 2 mM y NH4Cl 1 mM piruvato a 42 °C y pH 7,5. El carbonato se suministró gasificando los reactores con una mezcla de 98 % de aire y 2 % de CO2. Las tasas de dilución aplicadas oscilaron entre 0,035 y 0,07 h−1.

Nitrosocaldus cavascurensis se cultivó como un cultivo discontinuo en los mismos reactores, volumen y medio que se describe para N. viennensis, pero a 68 °C con NH4Cl 1 mM, piruvato 1 mM y pH 7,0. El carbonato también se suministró por gaseado, pero con una mezcla de aire/N2/CO2 para conseguir una mezcla de 10% O2 y 2% CO2. Para aumentar la biomasa, se añadió NH4Cl paso a paso con jeringas a través de un tabique para aumentar la concentración final de NO2− a aproximadamente 2,5 mM antes de recolectar los cultivos.

La biomasa cosechada se concentró en tres pasos de centrifugación. Primero con una centrífuga continua (CEPA modelo LE) funcionando a máxima velocidad. A continuación, la biomasa de la centrífuga continua se suspendió en volúmenes de 400 ml y se concentró utilizando un Sorvall Lynx 4000 con un rotor F12–6 × 500 durante 30 min a 4 °C y 16 000 × g. Finalmente, la biomasa se resuspendió en pequeños volúmenes y se dividió en alícuotas en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se concentró hasta obtener un sedimento final durante 30 min a 4 °C y 16 000 × g utilizando una centrífuga de sobremesa. Los pellets se congelaron a -70 °C hasta su posterior análisis.

Puede encontrar información detallada para el análisis bioinformático, la extracción de proteínas de membrana, los métodos BN-PAGE, los métodos Tricine-SDS-PAGE, la preparación de espectrometría de masas, el entrecruzamiento, el análisis de datos y las predicciones de multímeros AlphaFold en Materiales y métodos complementarios.

Brevemente, las células se lisaron y las fracciones de membrana se aislaron mediante ultracentrifugación (ultracentrífuga Beckman Coulter; SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor, kmax = 124; 200 000 × g) durante 90 min a 4 °C utilizando tubos de polipropileno de pared delgada de 13,2 ml con un nivel de la desaceleración se estableció en 7. Las proteínas de membrana se extrajeron usando n-dodecil-β-D-maltósido (DDM; Invitrogen BN2005) y se cargaron en un gel BN-PAGE prefabricado al 3-12% (Invitrogen BN1001). Las bandas seleccionadas se cortaron y analizaron mediante espectrometría de masas para la identificación de proteínas. Los procedimientos para la extracción de proteínas y la ejecución de un gel BN-PAGE se basaron en estudios previos [39, 40] y en el manual NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System de Life Technologies (MAN0000557). El diseño y análisis del estudio para la extracción de membrana y BN-PAGE se guió por estudios previos [41, 42] Los métodos de entrecruzamiento se basaron en protocolos de Hevler et al. (2021) [43].

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE [44] con los identificadores de conjuntos de datos PXD035349, PXD034632 y PXD034475 para BN-PAGE de N. viennensis, BN-PAGE de N. cavascurensis y cross- muestras vinculadas, respectivamente. Los scripts relevantes para el análisis se pueden encontrar en el repositorio de GitHub https://github.com/hodgskiss/Archaeal_AMO.

Nitrososphaera viennensis se cultivó en cultivo continuo durante varias semanas en condiciones óptimas de crecimiento para obtener suficiente biomasa para los análisis bioquímicos (Melcher et al. [45]). Se obtuvieron entre 800 y 2000 µg de proteínas de membrana a partir de 450–550 mg de biomasa por preparación, de los cuales aproximadamente 40–50 µg se cargaron por carril en geles PAGE nativos azules [39]. Después de la optimización de las condiciones, se cortaron 22 bandas y se sometieron a espectrometría de masas (ver Materiales y métodos complementarios; Fig. S1A). Las subunidades AMO (AmoA, AmoB y AmoC) se encontraban entre las proteínas más abundantes (22 % de la intensidad normalizada iBAQ) detectadas en general en estas fracciones de membrana. Los perfiles de intensidad relativa de AmoA, AmoB y AmoC mostraron tres picos distintos correspondientes a las bandas 4, 7 y 12, con el pico más prominente en la banda 7 (Fig. 1A). Las subunidades AmoA, AmoB y AmoC constituyeron el 10 %, 5 % y 14 %, respectivamente, de la proteína total que se encuentra en la banda 7 según las intensidades normalizadas de iBAQ. AmoX también estuvo presente en la banda 7 representando el 10%. Las señales más intensas para la subunidad AmoC estuvieron representadas por dos de los seis homólogos de AmoC, AmoC6 y AmoC4. Estos dos homólogos no pudieron distinguirse en base a los péptidos identificados en el gel BN-PAGE. Al desnaturalizar Tricine-SDS-PAGE de recortes de la banda 7, todos los componentes conocidos del complejo AMO se visualizaron y confirmaron mediante proteómica (Fig. 2). Además, esto permitió la identificación de péptidos únicos de la subunidad AmoC6 (ver Discusión complementaria).

Abundancia relativa de intensidades normalizadas iBAQ de subunidades AMO conocidas y putativas. Las intensidades de iBAQ para cada proteína se normalizan a la intensidad más alta detectada de esa proteína para crear un perfil de abundancia relativa para cada proteína. A Patrones de intensidad de AMO en N. viennensis. B Patrones de intensidad de AMO en N. cavascurensis. Las bandas seleccionadas para ser cortadas y analizadas mediante espectroscopia de masas se indican mediante corchetes numerados de izquierda (parte superior del gel) a derecha (parte inferior del gel) y corresponden a números en el eje x de las gráficas respectivas. Las escaleras para cada gel se representan en la parte inferior de los paneles respectivos.

Tricine-SDS-PAGE de bandas AMO de geles BN-PAGE. Comparación de tres métodos de tinción diferentes para geles Tricine-SDS-PAGE con marcadores de tamaño en el lado izquierdo. Las bandas cortadas para el análisis de un gel teñido con SimplyBlue SafeStain y digerido con tripsina se indican entre paréntesis. Los porcentajes representan el porcentaje de intensidades de proteína normalizadas iBAQ para cada banda individual. Los identificadores de banda se indican entre paréntesis. Las flechas verdes marcadas A, B, C y X representan las alturas esperadas de las bandas para las subunidades AMO AmoA, AmoB, AmoC y AmoX, respectivamente. Las flechas naranjas marcadas con A, B, C y X representan bandas equivalentes de AmoA, AmoB, AmoC y AmoX, respectivamente, de geles teñidos con plata. Un gráfico circular de la banda con la mayor cantidad de AmoC muestra el porcentaje de bandas de AmoC que provienen de homólogos de AmoC distinguibles.

Para identificar proteínas adicionales que podrían ser parte del complejo AMO archaeal, se realizó un análisis de correlación para encontrar candidatos con un patrón de migración similar al de las tres subunidades AMO primarias AmoA, AmoB y AmoC4/C6. Los patrones del 50 % de las proteínas más abundantes se compararon entre sí mediante una correlación de Kendall para determinar la probabilidad de dependencia entre varias proteínas, centrándose en las proteínas correlacionadas con subunidades AMO conocidas. Los criterios adicionales fueron (i) su presencia en AOA completamente secuenciados, y (ii) su ausencia en especies que no oxidan amoníaco [46]. Las dos proteínas que inicialmente cumplían con estos criterios eran la supuesta subunidad AMO AmoX y una proteína hipotética, NVIE_004540 (Tabla 1). Los patrones de migración de estas proteínas se pueden ver en la Fig. 1A. Si bien este proceso de selección imparcial produjo candidatos AMO adicionales, se necesitó un análisis adicional para verificar la presencia de estas subunidades recién identificadas y otras potenciales.

Los análisis anteriores de las subunidades conocidas dentro de las cepas del suelo, o la familia Nitrososphaeraceae (como se define en la base de datos de taxonomía del genoma [47]; utilizada en todas partes), han mostrado una falta general de agrupación espacial de todos los genes de subunidades conocidos anteriores. Sin embargo, dentro de las familias Nitrosopumilaceae y Nitrosocaldaceae, los genes para las subunidades AMO canónicas, AmoABC, y la subunidad propuesta AmoX son sinténicos [36, 48, 49]. Para investigar la colocalización de posibles genes de subunidades adicionales, se analizó el estado sinténico y la conservación en AOA de los cinco genes aguas arriba y aguas abajo del grupo de genes amo en Nitrosocaldaceae y Nitrosopumilaceae. De estos genes, 19 se conservaron en AOA y cinco se encontraron exclusivamente en AOA (Conjunto de datos complementarios 2). Los cinco genes de interés incluían dos genes amo canónicos (amoA y amoB) y los genes amoX, NVIE_004540 y NVIE_004550. La ausencia de amoC en los genes de interés se atribuye a una versión truncada que existe dentro del genoma de "Candidatus Nitrosopumilus koreensis AR1" (probablemente debido a problemas de ensamblaje) que impidió que se identificara como conservada en todos los AOA. El gen amoX se identificó previamente en estudios metagenómicos [15, 36] y NVIE_004540 ya era un candidato identificado a partir del análisis de correlación BN-PAGE. La proteína conservada adicional, NVIE_004550, se identificó recientemente y se encontró que estaba ubicada directamente aguas arriba de NVIE_004540, lo que indica una cotranscripción potencial. Los dos nuevos candidatos codifican polipéptidos de 9,6 kDa y 12,8 kDa respectivamente y, al igual que la subunidad candidata AmoX, su estructura secundaria predicha es predominantemente helicoidal y su localización subcelular transmembrana. Por lo tanto, los dos nuevos genes amo candidatos NVIE_004540 y NVIE_004550 se han denominado amoY y amoZ, respectivamente.

Un análisis más detallado en Nitrosocaldaceae, el primer linaje divergente en las reconstrucciones evolutivas de AOA [46, 50], reveló que los genes de las tres subunidades candidatas para AMO (AmoX, AmoY-homólogo de NVIE_004540 y AmoZ-homólogo de NVIE_004550) se agruparon espacialmente con las subunidades canónicas (AmoABC) y fueron sinténicas en Nitrosocaldus cavascurensis y Ca. Nitrosocaldus islandicus. La agrupación espacial de los seis genes de subunidades también se encuentra en MAG obtenidos recientemente [51] dentro del género Nitrosocaldus. En el caso del género recién propuesto Ca. Nitrosothermus [51], los genes amo se dividieron en múltiples contigs y synteny no pudo determinarse definitivamente (Fig. 3). Además, se infiere que los seis genes amo han sido adquiridos recientemente por el último ancestro común de AOA [46].

Izquierda: árbol filogenético de AOA basado en 32 proteínas ribosómicas conservadas, los valores de arranque ultrarrápido del 100 % se indican con círculos azules. Las etiquetas taxonómicas están coloreadas según la identidad de la familia GTDB [47], Nitrosocaldaceae-rojo, Nitrosopumilaceae-azul, Nitrososphaeraceae-naranja. Los clados/organismos en negrita se incluyeron en el análisis sinténico. Los clados se nombran de acuerdo con Alves et al. (2018) [34]. Derecha: Representación de patrones sinténicos generales en diferentes clados de AOA. Las brechas entre genes en el mismo contig están marcadas por una línea en zig-zag. Una barra inclinada doble indica contigs separados. Los números debajo de las líneas en zig-zag representan el número de genes entre los genes de la subunidad amo. Se puede encontrar un análisis más detallado y una lista completa de especies en la Fig. S11 y el Conjunto de datos complementario 2, respectivamente.

La aparición de Nitrosopumilaceae estuvo acompañada de una separación de esta región genómica en un grupo primario que contenía amoABCX y un grupo secundario que contenía amoYZ (Fig. 3). Dentro de Nitrosotalea sp., Estos grupos están separados por 11 o 12 genes, mientras que el resto de las especies de Nitrosopumilaceae tienen estos grupos separados por solo 1 o 2 genes (con la excepción de la esponja simbionte Ca. Cenarchaeum symbiosum). El surgimiento de la familia Nitrososphaeraceae condujo a una dispersión de todos los genes de las subunidades en el genoma, con la excepción de amoA y amoX, que generalmente están vinculados.

Aunque se identificó amoZ en el análisis genómico, la proteína AmoZ (NVIE_004550) no se correlacionó con AmoABC en el gel BN-PAGE de N. viennensis. Al examinar el perfil de abundancia relativa de AmoZ, se siguió el patrón general de los picos del péptido AMO. Sin embargo, esto no se detectó en el análisis de correlación debido a que se produjo un pico de abundancia relativa alto en la parte inferior del gel que alcanzó su punto máximo en la última banda tomada a aproximadamente 66 kDa según la escalera BN-PAGE (Fig. 1A). Esto está por encima de la masa predicha de 12,8 kDa, pero sugiere que AmoZ también podría ser parte de AMO, pero una asociación más débil posiblemente conduzca a su disociación del complejo y migración al fondo del gel.

Para probar la composición del complejo AMO fuera del contexto de N. viennensis, se aplicó el enfoque BN-PAGE a las fracciones de proteína de membrana de N. cavascurensis, una especie AOA termófila lejanamente relacionada de la familia Nitrosocaldaceae [48] que se obtuvo recientemente en cultivo puro (Melcher et al. en preparación). Aunque se obtuvo un patrón ligeramente diferente de complejos (Fig. 1B), también se observó una correlación de las subunidades adicionales con AmoA, AmoB y AmoC en este organismo termofílico (correlación de proteínas de Kendall, como se realizó para N. viennensis). Las tres proteínas AmoX, NCAV_0488 (AmoY) y NCAV_0486 (AmoZ) tenían patrones de migración dentro del gel que se correlacionaban fuertemente con AmoABC (Tabla 1). Este análisis confirmó que las subunidades propuestas se tradujeron en N. cavascurensis y potencialmente tenían una conexión física dentro del complejo AMO.

Para estimar la proximidad física de las subunidades propuestas a las subunidades conocidas y otras proteínas dentro del gel BN-PAGE, se realizó un entrecruzamiento en el gel [43] usando el entrecruzante disuccinimidil sulfóxido (DSSO) en un corte adicional de BN-PAGE -fuera de la banda 7 (Fig. S1B). La espectrometría de masas y el análisis de entrecruzamiento mostraron múltiples entrecruzamientos entre AmoA, AmoB, AmoC y AmoX, así como con las dos subunidades recientemente propuestas, AmoY y AmoZ (Fig. 4C). Muchos enlaces cruzados también se conectaron a NVIE_016740, una supuesta proteína de la capa S que probablemente representa una proteína de la capa superficial muy abundante como se conoce de otras arqueas (SlaA) [52, 53]. Como esta proteína supuestamente ayuda a establecer el pseudoperiplasma en AOA, no es sorprendente encontrarla fuertemente entrecruzada con proteínas de membrana.

A, B Representaciones de dibujos animados de los modelos de estructura AlphaFold de los hexámeros de N. viennensis (A) y N. cavascurensis (B), que indican su supuesta orientación de membrana basada en el análisis de hidropatía de secuencia. Las subunidades están coloreadas de la siguiente manera: AmoA, gris claro; AmoB, negro; AmoC, salmón; AmoX, lavanda; AmoY, cian; AmoZ, azul. Los residuos en los sitios de cobre CuB y CuC están representados en barras rojas. Los enlaces disulfuro se indican en amarillo. C Representación de enlaces cruzados identificados entre las subunidades AMO existentes y propuestas de una banda AMO cortada de un gel BN-PAGE de N. viennensis. Verde: subunidades sospechosas basadas en genómica comparativa. Azul: subunidades recién propuestas basadas en correlación BN-PAGE y análisis sinténico. D Enlaces cruzados dentro del umbral de la distancia de la superficie accesible del solvente (SASD) para DSSO, representados en verde, mapeados en el modelo AlphaFold de N. viennensis. El único enlace cruzado observado entre las subunidades AmoZ y AmoB se representa en magenta, ya que viola los criterios de distancia SASD (50,0 Å) pero está dentro del rango de distancia euclidiana (31,8 Å). E Distribución de distancias SASD y euclidianas Cα–Cα de enlaces cruzados DSSO únicos identificados con Annika y MeroX. Veintisiete de los 67 enlaces cruzados únicos cumplieron con los criterios de distancia (SASD < 35,0 Å). F Porcentaje de combinaciones de subunidades entrecruzadas.

AmoX también tenía enlaces cruzados individuales con varias otras proteínas (Conjunto de datos complementario 1). Como solo se encontraron conexiones únicas, y estas proteínas no aparecieron en ningún otro análisis sinténico o correlativo, no se consideró que representaran un papel estructural en el complejo AMO. Estos enlaces cruzados pueden atribuirse más bien a la gran abundancia de esas proteínas en la membrana celular.

Se inspeccionaron los estudios transcriptómicos disponibles de AOA para explorar si los patrones de expresión de las subunidades recién predichas corroborarían su participación en la AMO. Un estudio reciente sobre la limitación de cobre en N. viennensis [54] confirmó que los genes amoA, amoB y amoC tienen algunos de los niveles de transcripción más altos en la célula, como también se demostró en estudios anteriores [55,56,57]. Un análisis de agrupamiento del mismo conjunto de datos reveló que amoA, amoB, amoC, amoX, amoY y amoZ parecen estar co-regulados y cayeron en los grupos que contienen los genes más expresados. (Fig. S2; Conjunto de datos complementario 2). Si bien pueden identificarse secuencias promotoras transcripcionales putativas para la mayoría de los genes amo, no se identificó un motivo promotor conservado obvio para los seis genes.

Una reevaluación de estos datos transcriptómicos (ver Métodos) también reveló que amoC6 es el homólogo de amoC transcrito principalmente (Fig. 5), lo que confirma la identificación de un péptido AmoC6 único de una banda Tricine-SDS-PAGE digerida con quimotripsina (Discusión complementaria ; Conjunto de datos complementario 1). En conjunto, esto indica que AmoC6 es el principal homólogo estructural de AmoC en el complejo AMO de N. viennensis, al menos en las condiciones de crecimiento aplicadas.

Representación genómica de N. viennensis que muestra la ubicación de los genes amo y los valores promedio de la transcripción transformada log2 por millón (TPM) de condiciones repletas de cobre en Reyes et al. (2020) [54]. Las barras naranjas en el genoma indican las ubicaciones de los genes de la subunidad AMO que se expresan fuertemente. Las barras azules en el genoma indican genes amo que tienen una actividad transcripcional baja. Los recuadros muestran genes amo (en negrita) y vecinos inmediatos coloreados en función de la expresión génica promedio de cultivos repletos de cobre. El rojo indica una expresión fuerte mientras que el azul representa una expresión baja o ausente. Todos los genes amo fuertemente expresados ​​se encontraron en grupos de genes altamente expresados ​​en condiciones limitadas y repletas (ver Fig. S2).

La transcriptómica de la cepa marina Nitrosopumilus maritimus también mostró una alta expresión de amoA, amoB, amoC, amoX y amoY (Nmar_1506). El gen amoZ (Nmar_1507), aunque syntenic con amoY, mostró menores niveles de expresión [55].

Las tres subunidades AMO recientemente propuestas también se inspeccionaron en conjuntos de datos proteómicos que se generaron con métodos que permitían una mejor recuperación de proteínas de membrana. Las seis subunidades conocidas y propuestas se encontraron en fracciones de membrana de N. viennensis de un estudio anterior [15], así como en el proteoma de N. maritimus [55]. En otros estudios proteómicos de AOA [58, 59], las tres nuevas subunidades no siempre estuvieron presentes, probablemente debido a su pequeño tamaño y número limitado de sitios de escisión de tripsina.

Como se observó previamente [60], las comparaciones de las secuencias de aminoácidos de las tres subunidades AmoA, AmoB y AmoC de las arqueas con las de las bacterias indican que las principales diferencias entre las subunidades AMO de las arqueas y las subunidades AMO bacterianas son hélices transmembrana faltantes, en menos uno en AmoB y dos en AmoC, y una porción soluble C-terminal faltante encontrada en AmoB/PmoB bacteriano (Figs. S3–S5). Estas observaciones también son válidas para el nuevo clado de AMO archaeal descubierto recientemente en el filo Thermoplasmata [61]. Una búsqueda HMMER utilizando las regiones extendidas de los homólogos bacterianos contra los genomas de AOA recolectados no reveló similitudes significativas. Por lo tanto, se llevó a cabo una búsqueda estructural general utilizando Phobius [62] con el genoma de N. viennensis para buscar genes que pudieran codificar una proteína con los siguientes criterios: (i) 1–3 hélices transmembrana, (ii) conservación en todos los AOA [46], y (iii) presentes en los 100 mejores genes transcritos [54] (niveles similares a los de las subunidades AMO primarias). Esto reveló seis posibles candidatos (Tabla 2). Los únicos candidatos que cumplieron con los requisitos estructurales y mantuvieron patrones de migración sintéticos y similares en BN-PAGE fueron amoX, amoY y amoZ.

La adición de las tres subunidades propuestas en arqueas aumenta el número de hélices transmembrana de 10–11 a aproximadamente 14 por protómero, lo que lo hace comparable al número que se encuentra en las estructuras cristalinas bacterianas de pMMO donde cada protómero del trímero (es decir, una unidad de PmoABC ), contiene 14-15 hélices transmembrana [23, 63].

Para obtener información sobre el contexto estructural del complejo AMO archaeal a la luz de tres subunidades propuestas adicionales, se obtuvo un modelo estructural para la organización del complejo AMO de N. viennensis mediante el empleo de la versión con capacidad multimérica de AlphaFold 2.1 [64,65 ,66]. Los modelos resultantes eran todos similares y representaban predicciones seguras (modelo superior, pLDDT = 71,4 y puntuación ptm = 0,668). Todas las hélices transmembrana predichas de AmoX, AmoY y AmoZ juegan un papel en el anclaje del complejo en la membrana junto con las hélices transmembrana de AmoA, AmoB y AmoC (Fig. 4A). Además, se predijo que el dominio N-terminal de AmoZ contenía dos hélices alfa que interactúan con el dominio N-terminal de AmoB, lo que posiblemente reemplace el papel del dominio soluble C-terminal faltante que se encuentra en PmoB y ofrezca la pieza final del complejo faltante en arqueas (información adicional en Discusión complementaria). También se predijo que se formaría un enlace disulfuro dentro del dominio soluble de AmoZ. La estructura general es comparable a un protómero del complejo pMMO (Fig. S6).

Para comparar el grado de conservación de la organización hexámera predicha del complejo AMO, también se obtuvo un modelo estructural del complejo AMO de N. cavascurensis (Fig. 4B). Los modelos resultantes fueron similares en su disposición general entre sí y con el modelo de N. viennensis, con puntuaciones de confianza generales altas (modelo superior, pLDDT = 77,7 y puntuación ptm = 0,591). Las diferencias entre los modelos N. viennensis y N. cavascurensis incluyen la localización de la hélice transmembrana (TM) de AmoZ. En N. viennensis, se prevé que la hélice TM interactúe principalmente con la hélice TM de AmoY, mientras que en N. cavascurensis se prevé que interactúe con las TM de AmoB y AmoA (Figs. 4A, B, S7A, C). Esto afectaría el posicionamiento relativo del dominio N-terminal de AmoZ con respecto al dominio soluble de AmoB, lo que permitiría una conformación más "abierta". Sin embargo, el bucle extendido que conecta el par de hélices N-terminal en AmoZ con el dominio TM teóricamente permite cierta flexibilidad (información adicional en Discusión complementaria, Fig. S8).

Los datos de los experimentos de entrecruzamiento en N. viennensis se asignaron al modelo predicho y respaldaron firmemente las interacciones predichas (Fig. 4D) con algunas excepciones. De los 67 enlaces cruzados únicos observados, 27 (40 %) cumplieron con un umbral máximo de distancia superficial accesible al solvente (SASD) de ≤35 Å (Fig. 4E) e involucraron todas las combinaciones de subunidades con la excepción de AmoZ (Fig. 4F). AmoZ solo participó en interacciones de entrecruzamiento >35 Å, lo que respalda una asociación más débil con el complejo como se observa en los patrones de migración de BN-PAGE.

El complejo archaeal AMO es una enzima clave del metabolismo energético AOA que se expresa en gran medida en todos los organismos oxidantes de amoníaco investigados y tiene grandes implicaciones para el medio ambiente debido a su abrumadora presencia en muchos ecosistemas [8,9,10,11,12,13, 14, 67]. El trabajo aquí se beneficia de las mejoras recientes en el cultivo de AOA en cultivos continuos (Melcher et al. en preparación) y presenta evidencia bioquímica y genómica comparativa novedosa sobre la composición del complejo AMO en Nitrososphaera viennensis y otros AOA que contrasta con la propuesta. composición de este complejo dentro de AOB.

El presente análisis ha verificado que AmoX, NVIE_004540 y NVIE_004550 probablemente estén presentes dentro del complejo archaeal AMO y propone la denominación de NVIE_004540 y NVIE_004550 como AmoY y AmoZ, respectivamente. Este hallazgo se basa en una serie de análisis independientes que incluyen enfoques proteómicos, genómicos, transcriptómicos, estructurales y de modelado. La presencia de seis subunidades en lugar de tres es exclusiva del dominio archaeal y podría representar una estrategia reguladora más compleja para el complejo AMO en archaea. Las diferencias en la vía de oxidación del amoníaco ya están bien establecidas entre los dominios de arqueas y bacterias (es decir, segundo paso no resuelto en arqueas [19, 21]; citocromos c basados ​​en hierro [68, 69] y ubiquinona en bacterias [70, 71] vs. plastocianinas a base de cobre [15, 16] y menaquinona en arqueas [72]). Las diferentes características dentro del complejo AMO observadas en este trabajo subrayan aún más estas diferencias y se suman a un creciente cuerpo de evidencia de que AOA y AOB participan en la nitrificación bajo diferentes restricciones ambientales y/o funcionales.

En los geles de proteína PAGE nativos azules, el complejo AMO tanto en N. viennensis como en Nitrosocaldus cavascurensis migró muy por encima de la altura prevista de un complejo de protómero trimérico, incluso al considerar las subunidades adicionales (peso molecular previsto de un complejo homotrimérico con seis subunidades por protómero: 296,9 kDa N. viennensis, 305,1 kDa N. cavascurensis). Las bandas de AMO archaeal también se observan en un peso molecular más alto en el gel en comparación con el complejo PMO bacteriano homólogo de una especie de Methylomirabilis que también se extrajo usando n-dodecil-β-D-maltósido (DDM) [73]. Esto podría explicarse por diferencias en la composición de la membrana de las cepas o diferencias potenciales en la oligomerización del protómero. Los AOA contienen lípidos únicos unidos a éter (es decir, crenarqueoles) [37, 74,75,76,77,78] y dependen de una capa S proteica en lugar de una membrana externa para crear un espacio pseudoperiplásmico [52, 53] . Lo más probable es que la observación de tres picos distintos de AMO se explique por la comigración con otras proteínas o complejos con los que podría estar interactuando físicamente, en particular con la proteína de la capa S.

Trabajos previos sobre bacterias que dependen de CuMMO han identificado otras proteínas putativas involucradas en el complejo. Las transcripciones monocistrónicas que contenían amoABC de AOB Nitrosococcus oceani ATCC 19707 contenían dos genes adicionales asignados como amoR y amoD [79]. Se descubrió que el gen amoR solo estaba presente en Nitrosococcus y, por lo tanto, no se pensó que fuera una parte conservada de AMO bacteriano. Un estudio reciente indicó que AmoD/PmoD (y probablemente el homólogo AmoE) juegan un papel crucial en la homeostasis del cobre, pero no se sospecha que sean una parte estructural de ningún complejo CuMMO [80]. Más bien, las estructuras cristalinas y crio-EM de la PMO bacteriana han confirmado consistentemente una estructura de protómero trimérico con una subunidad de PmoA, PmoB y PmoC que forman cada protómero [22,23,24,25,26,27,28].

Aunque existe un debate sobre qué subunidad alberga el sitio activo principal en los complejos CuMMO, existe una clara evidencia de que los sitios metálicos en PmoC juegan un papel fundamental en el complejo de metanótrofos [27, 28, 31, 32]. Mientras que el AmoC archaeal carece de una sección sustancial que se encuentra en todas las bacterias que corresponde a dos hélices transmembrana (Fig. S5), el sitio de metal observado en estructuras cristalinas anteriores, así como el sitio de metal recientemente propuesto identificado a través de cryo-EM [28], son conservado en todas las especies de arqueas y bacterias (Fig. S5). La importancia de esta subunidad también está respaldada por estudios de mutagénesis dirigida al sitio en las actinobacterias genéticamente manejables que contienen la monooxigenasa de hidrocarburo homóloga [32].

El modelo de suelo AOA, N. viennensis, como la mayoría de los otros AOA que habitan en el suelo de la familia Nitrososphaeraceae, codifica múltiples homólogos del gen amoC mientras retiene solo copias únicas de amoA y amoB [15] (Conjunto de datos complementarios 2). Algunas copias AOB terrestres codifican copias adicionales de amoC que están espacialmente desconectadas del operón AMO y se implicaron en la respuesta al estrés según los estudios transcripcionales [81, 82]. Dentro de Nitrososphaeraceae, no existen operones AMO conservados (Fig. 3). Las duplicaciones del gen amoC (espacialmente distantes de los otros genes AMO) también ocurren en algunas especies de la familia asociada marina AOA (Nitrosopumilaceae) y en dos MAG de termófilos AOA (Nitrosocaldaceae), todos descubiertos en sedimentos [51, 83, 84] . También se encuentra una duplicación de amoC en un simbionte de esponja AOA e incluso se encuentran copias de amoC arqueales en virus marinos [85]. Estos hallazgos juntos pueden indicar la importancia metabólica de la subunidad AmoC para las adaptaciones ecofisiológicas en la oxidación del amoníaco. Si bien este trabajo identificó un AmoC en particular (AmoC6; NVIE_028540) como el principal homólogo dentro del complejo de N. viennensis, es posible que (algunas de) las otras subunidades de AmoC, que surgieron por duplicación de genes a nivel de género (Fig. S9), podría incorporarse bajo ciertas condiciones ambientales y proporcionar diferentes perfiles de actividad a la enzima.

Más allá de la genómica comparativa, la única información estructural confirmada para las arqueas proviene de la estructura cristalina de una AmoB heterólogamente expresada que se origina en Candidatus Nitrosocaldus yellowstonensis [86]. Esta estructura confirmó la falta del dominio de cupredoxina C-terminal y reveló una región de aminoácidos extendida que no se encuentra en bacterias formada por dos hélices y dos bucles. Se propuso que esta región adicional podría ayudar a estabilizar el dominio de cupredoxina existente ya que faltan interacciones de apoyo debido a la ausencia del dominio C-terminal. Sin embargo, esta extensión de aminoácidos solo se encuentra dentro del género propuesto de Nitrosocaldus (Fig. S4). Es más probable que el dominio soluble de AmoZ, que se conserva en todos los AOA, confiera esta función estabilizadora.

En ausencia de análisis estructura-función adicionales, no está claro si las subunidades adicionales en el complejo archaeal simplemente reflejan la gran distancia evolutiva a todos los demás complejos proteicos conocidos de la familia CuMMO [34], o si esta diferencia en la estructura también tiene un efecto relevante. implicaciones funcionales. Por ejemplo, los complejos AMO bacterianos son enzimas promiscuas capaces de oxidar el metano y otros compuestos [87,88,89,90]. Tales investigaciones sobre sustratos alternativos aún no se han realizado con el complejo de arqueas, pero serían importantes para evaluar el papel funcional de las arqueas (y posiblemente las nuevas subunidades) en el medio ambiente. Además, se han identificado diferencias en el complejo AMO entre especies de AOA que tienen el potencial de afectar la función del complejo AMO. Esto incluye el bucle AmoB adicional que se encuentra dentro de Nitrosocaldus, pero también está claramente demostrado por la subunidad AmoZ recientemente propuesta. Se predice que el género Nitrososphaera y la familia Nitrosocaldaceae (ambos investigados en este estudio) forman un enlace disulfuro que une las dos hélices alfa que forman el dominio soluble de AmoZ (Figs. S7B, D, S10C) a través de dos cisteínas que no se conservan en otro AAO. Además, se predice que el género Nitrosocosmicus contiene un dominio de cinta de zinc adicional representado por cuatro residuos de cisteína en el extremo C-terminal, que presumiblemente reside dentro del citoplasma (Fig. S10C). Las observaciones de un enlace disulfuro y un dominio de cinta de zinc dentro de ciertos linajes AOA podrían vincularse a la sensibilidad a las especies reactivas de oxígeno y estrategias de regulación únicas, respectivamente, y pueden reflejar patrones únicos de evolución que complementan aspectos aún desconocidos del metabolismo de estos grupos específicos.

Independientemente de las diferencias específicas de las especies en las arqueas, la estructura general de las arqueas predicha, con las nuevas subunidades, refleja la composición conocida de protómeros bacterianos (Fig. S6). La prueba definitiva de la oligomerización y organización de estas subunidades no será posible hasta que se realice una estructura definitiva (es decir, cristal o crio-EM) de AMO archaeal. Los sitios putativos de interacción del protómero en la estructura crio-EM de Methylococcus capsulatus str Bath (estructura PDB 7S4H) [28] parecen estar en la sección de PmoB que falta en las arqueas (Fig. S4). Sin embargo, la ubicación de AmoY y AmoZ en las regiones externas del protómero podría estar facilitando estas interacciones (Fig. S7). Esto también podría explicar la gran cantidad de interacciones que violan SASD entre AmoY y AmoZ, ya que el análisis solo tiene en cuenta un solo protómero (Fig. 4F). Es posible que estas interacciones puedan ser, en cambio, entre subunidades de AmoY y AmoZ en diferentes protómeros. Por lo tanto, los modelos de protómero predichos de N. viennensis y N. cavascurensis no descartan la posibilidad de un complejo AMO arqueal trimérico. Con respecto a la orientación, el enfoque de modelado actual no puede predecir exactamente cómo se asienta el AMO archaeal en la membrana. Sin embargo, es probable que el sitio activo, así como los dominios solubles AmoB y AmoZ, estén situados hacia el espacio pseudoperiplásmico. Esto está respaldado por esfuerzos de modelado previos del transporte de nutrientes en la capa S de AOA [91], así como por el etiquetado de inmunooro basado en actividad de complejos CuMMO en AOB y metanótrofos [92].

En conclusión, este estudio proporciona evidencia a través de datos genómicos, proteómicos y transcriptómicos de la presencia de AmoX y la inclusión de AmoY y AmoZ como subunidades dentro del complejo archaeal AMO. Por lo tanto, un solo protómero de la arquea AMO constaría de seis subunidades en lugar de tres como en otros complejos de la familia CuMMO. La adición de las nuevas subunidades haría que la cantidad de hélices transmembrana fuera comparable a los complejos CuMMO que se encuentran dentro de las bacterias. Como se ha demostrado previamente que el anclaje de pMMO en la membrana es crítico para su actividad [26, 28], parece plausible que las subunidades recién identificadas desempeñen un papel importante para la integridad estructural y funcional del complejo AMO de arqueas. La presencia de un dominio soluble dentro de AmoZ que podría reemplazar la función estabilizadora del dominio soluble faltante en AmoB también cumple con una pieza faltante potencialmente crucial del complejo AMO. Dado que AmoXYZ parece tener funciones estructurales importantes, será imperativo incluir todas las subunidades en futuros estudios estructurales y de expresión de este complejo proteico ambientalmente relevante en arqueas. Teniendo en cuenta la amplia distribución de AOA en prácticamente todos los ecosistemas [8,9,10,11,12,13,14, 34] y su relevancia ecológica, será necesario desarrollar herramientas genéticas para AOA y mejorar su producción de biomasa para permitir la estructura-función análisis y dilucidar el camino completo de la oxidación del amoníaco en estas arqueas.

Todos los datos proteómicos se depositaron en el ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE [44] con los identificadores PXD035349, PXD034632 y PXD034475 para BN-Page de N. viennensis, BN-PAGE de N. cavascurensis y muestras reticuladas, respectivamente. Los scripts y códigos relevantes para el análisis de datos se pueden encontrar en el repositorio de GitHub https://github.com/hodgskiss/Archaeal_AMO.

Se ha publicado una corrección de este artículo: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01403-2

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Agradecemos a Anas Mohammed Mardini por su excelente asistencia técnica en el cultivo de N. viennensis y Wolfram Weckwerth por su valioso aporte en las discusiones iniciales del proyecto. También agradecemos a Florian Sikora y al Dr. Boris Görke por la asistencia técnica y el uso de la máquina OneShot para la lisis celular y a la Dra. Stephanie Eichorst por la asistencia y el uso de la ultracentrífuga. También agradecemos al Dr. Thomas Rattei, Florian Goldenberg y Johann Dorn de la División de Biología de Sistemas Computacionales (CUBE) por brindar mantenimiento y acceso al Clúster de Computación de Ciencias de la Vida (LiSC) en la Universidad de Viena.

Este proyecto fue apoyado por Doktoratskolleg (DK) más: Ciclo de nitrógeno microbiano: de células individuales a ecosistemas (Austrian Science Fund W1257), ERC Advanced Grant TACKLE (No. 695192) y el programa de investigación e innovación Horizon 2021-2027 de la Unión Europea bajo convenio de subvención n° 101079299.

Unidad de Biología y Ecogenómica de Archaea, Departamento de Ecología Funcional y Evolutiva, Universidad de Viena, Viena, Austria

Logan H. Hodgskiss, Michael Melcher, Melina Kerou, Rafael I. Ponce-Toledo y Christa Schleper

Instalación de Espectrometría de Masas, Max Perutz Labs, Vienna BioCenter (VBC), Viena, Austria

Weiqiang Chen y Markus Hartl

Centro VIB para el Centro de Inflamación y Departamento de Bioquímica y Microbiología, Universidad de Gante, Gante, Bélgica

Savvas N. Savvides

Unidad de Biología de Sistemas Moleculares, Departamento de Ecología Funcional y Evolutiva, Universidad de Viena, Viena, Austria

Stefanie Wienkoop

Departamento de Bioquímica y Biología Celular, Laboratorios Max Perutz, Universidad de Viena, Viena, Austria

Markus Hartl

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LHH, MK, SW, MH y CS conceptualizaron el proyecto de investigación. La investigación fue realizada por LHH, MK, WC, SNS y RIPT. La producción de biomasa fue realizada por MM. LHH, MK y CS escribieron el documento con ediciones y contribuciones de MM, WC, RIPT, SNS, SW y MH.

Correspondencia a Christa Schleper.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Se revisó la versión original en línea de este artículo: En este artículo, los detalles de afiliación de Savvas N. Savvides se proporcionaron incorrectamente. Debería haber sido "Centro VIB para el Centro de Inflamación y Departamento de Bioquímica y Microbiología, Universidad de Gante, Gante, Bélgica".

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Reimpresiones y permisos

Hodgskiss, LH, Melcher, M, Kerou, M et al. Complejidad inesperada de la amoníaco monooxigenasa en arqueas. ISME J 17, 588–599 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01367-3

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Recibido: 08 julio 2022

Revisado: 09 enero 2023

Aceptado: 12 de enero de 2023

Publicado: 31 enero 2023

Fecha de emisión: abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01367-3

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El Diario ISME (2023)