Aplicación de organoides inmunes mejorados en el modelado de investigación personalizada de carcinoma de células de Merkel

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13865 (2022) Citar este artículo

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El carcinoma de células de Merkel (CCM) es un cáncer cutáneo neuroendocrino poco frecuente, con una incidencia inferior a 1/100.000, bajas tasas de supervivencia y respuesta variable a la quimioterapia o la inmunoterapia. Aquí exploramos la aplicación de organoides tumorales de pacientes (PTO) en el modelado de investigación personalizada en esta rara neoplasia maligna. Las células tumorales de MCC no clasificadas y no expandidas se aislaron de muestras quirúrgicas y se suspendieron en un hidrogel basado en ECM, junto con tejido de ganglios linfáticos y sangre del paciente para generar organoides inmunes mejorados (iPTO). Los organoides se trataron con agentes de quimioterapia o inmunoterapia y la eficacia se determinó mediante la viabilidad posterior al tratamiento. Se reclutaron nueve muestras de siete pacientes entre diciembre de 2018 y enero de 2022. La tasa de establecimiento fue del 88,8 % (8/9) para PTO y del 77,8 % (7/9) para iPTO. La histología en tejidos de pacientes emparejados y PTO demostró la expresión de marcadores de MCC. La respuesta a la quimioterapia se mostró en 4/6 (66,6 %) de las muestras con cisplatino y doxorrubicina como los agentes más efectivos (4/6 juegos de PTO), mientras que la inmunoterapia no fue efectiva en los juegos de iPTO probados. Cuatro muestras de dos pacientes demostraron resistencia a pembrolizumab, lo que se correlaciona con la respuesta al tratamiento del paciente correspondiente. El establecimiento de rutina y la mejora inmunológica de MCC PTO es factible directamente a partir de muestras quirúrgicas resecadas, lo que permite la investigación personalizada y la exploración de regímenes de tratamiento en el entorno preclínico.

El carcinoma de células de Merkel (MCC) es un cáncer cutáneo neuroendocrino poco frecuente y agresivo con una incidencia anual estimada de 0,7 casos por 1.000.0001 y peores resultados de supervivencia que el melanoma. Si bien las primeras investigaciones sugirieron que el MCC surgió del origen de la cresta neural, la evidencia más reciente apunta a progenitores epidérmicos2,3. La transformación maligna resulta como una secuela de la infección con el poliomavirus de células de Merkel (MCPyV) en aproximadamente el 60-80 % de los cánceres de MCC, mientras que en un subconjunto más pequeño de pacientes está relacionado con la exposición a los rayos UV4, con los dos eventos aumentando sinérgicamente la carga mutacional y la neoantigenicidad de tumores MCC.

La mayoría de los pacientes con CCM presentan enfermedad locorregional que requiere resección quirúrgica seguida de radiación adyuvante en pacientes seleccionados4. En pacientes con enfermedad metastásica, existen opciones limitadas, mientras que la rareza de MCC dificulta la acumulación de pacientes para estudios comparativos con nuevos agentes5,6. Existe un interés cada vez mayor en los inhibidores de puntos de control, así como en el desarrollo de una vacuna MCPyV7,8,9. Sin embargo, a pesar de los resultados prometedores con la inmunoterapia que dieron como resultado la aprobación de la FDA en 2017, al igual que con muchos otros tipos de cáncer, la resistencia tumoral adquirida sigue siendo un problema grave junto con la toxicidad relacionada con la inmunoterapia10. Por lo tanto, predecir el posible fracaso del tratamiento es importante para evitar los efectos adversos relacionados con el tratamiento en los casos en los que no se espera un beneficio de supervivencia.

Debido a la baja incidencia de MCC, se requieren opciones alternativas a los ensayos clínicos para determinar la eficacia del tratamiento preclínico. Anteriormente informamos sobre el modelado exitoso de organoides de varios tipos de tumores, incluidos el mesotelioma, el pulmón, el apéndice, el melanoma, el sarcoma y los primarios colorrectales11,12,13,14,15,16. Es importante destacar que algunos de estos estudios analizaron subtipos de tumores raros que han visto pocos avances en el manejo clínico en las últimas décadas. Estos organoides se crearon con éxito en un sistema de hidrogel altamente controlado compuesto por colágeno y ácido hialurónico, lo que eliminó la necesidad de extracto de membrana basal xenogénico para el cultivo. Los PTO estaban listos para las pruebas preclínicas en el plazo de 1 semana desde la fabricación, proporcionando datos de tratamiento dentro de un marco de tiempo relevante para respaldar e informar potencialmente las decisiones clínicas. Estos estudios pudieron demostrar la utilidad potencial en aplicaciones de medicina de precisión tanto para terapias aprobadas como en investigación12,15,17,18.

Aquí mostramos la viabilidad de estos enfoques en el desarrollo de PTO para crear una plataforma de investigación clínica personalizada para MCC a nivel del paciente individual. Demostramos la biofabricación de MCC PTO a partir de tejidos de pacientes resecados y mostramos similitud en los marcadores de tejido para los tumores. Analizamos el uso de regímenes de quimioterapia en investigación y tratamientos de inmunoterapia aprobados para comparar la eficacia. Finalmente, pudimos comparar los resultados de resecciones temporalmente distintas del mismo paciente con su resultado clínico. Creemos que los datos presentados muestran la utilidad de los PTO en la investigación de MCC y, en el futuro, potencialmente como una herramienta complementaria preclínica en tumores malignos raros.

Se adquirieron nueve muestras de tumores de siete pacientes durante el período de estudio de diciembre de 2018 a enero de 2022 (Tabla 1). Ocho de los tumores proporcionaron suficientes células para producir organoides para la detección de terapias. Un paciente se sometió a una segunda y tercera operación por enfermedad recurrente mientras recibía inmunoterapia y ambas muestras adicionales se procesaron en organoides. Además, siete tejidos proporcionaron suficientes células tumorales con especímenes separados para linfocitos para pruebas de inmunoterapia paralelas, con seis juegos usando sangre del paciente y un juego usando un ganglio linfático resecado (Fig. 1). Después de la biofabricación, los PTO se cultivaron durante 7 días y se sometieron a 3 días de pruebas de drogas. En general, los resultados de las pruebas de detección de drogas para todas las muestras estuvieron disponibles en 10 días, lo que eliminó la necesidad de expansión celular y generó datos específicos del paciente dentro de un cronograma clínicamente relevante.

Diagrama de flujo de la fabricación de organoides de carcinoma de células de Merkel. Las células tumorales se aislaron del tejido tumoral digerido y se fabricaron en PTO, mientras que las células inmunitarias se aislaron de la sangre del paciente o del tejido linfático y se combinaron con células tumorales para crear iPTO. Estos organoides se cultivaron durante 1 semana, después de lo cual se caracterizaron y seleccionaron para determinar su eficacia terapéutica. Creado con BioRender.com.

El mantenimiento de las células tumorales primarias en cultivo de organoides es esencial para una representación precisa del tejido y una respuesta adecuada a la intervención terapéutica. La tinción comparativa de tejido resecado y PTO demostró un alto nivel de correspondencia para identificar las manchas (Fig. 2 y Fig. S1 complementaria). Se exhibe una morfología celular similar en tejido de pacientes y PTO coincidentes, mientras que los iPTO demostraron poblaciones de células inmunitarias (Fig. 2a, b, i y ii). Las expresiones positivas de Pan-Cytokeratin y CK20 se usan comúnmente para diferenciar MCC de otros orígenes tumorales, incluido el melanoma y otros tumores neuroendocrinos metastásicos (Fig. 2a,b, iii y iv)19. Obteniendo su nombre del linaje de neuronas sensoriales de células de Merkel del que puede derivarse, MCC también demuestra una expresión positiva de marcadores neurales que incluyen sinaptofisina, neurofilamento y cromogranina20. También se muestra que estos marcadores tienen una alta correlación entre la PTO y el tejido coincidentes (Fig. 2a, b, v-vii). Además, se supone que el poliomavirus de células de Merkel (MCPyV) desempeña un papel importante en el desarrollo de la enfermedad, ya que hasta el 80 % de los casos de pacientes tienen el virus presente. Observamos expresión positiva en 5 de 7 (71%) tumores de pacientes (Fig. 2a, b, viii). La tinción IHC de PTO y tejido demostró falta de expresión para CD45 y S100, eliminando diagnósticos alternativos que simulan morfológicamente MCC, incluidos linfoma y melanoma, respectivamente (Figura complementaria S2).

Inmunohistoquímica de tejido de paciente coincidente (Bx) y conjunto de PTO de carcinoma de células de Merkel (a) MCC5 y (b) MCC7. La comparación de tejido y PTO muestra una alta concordancia de marcadores de identificación que incluyen (i) morfología celular (H&E), (ii) morfología celular iPTO (H&E), (iii) pancitoqueratina (Pan CK), (iv) citoqueratina 20 (CK20), (v) neurofilamento (NFH), (vi) cromogranina A (ChgA), (vii) sinaptofisina (SYP y (viii) poliomavirus de células de Merkel (MCPyV). Además, los conjuntos MCC5 (a) y MCC7 (b) demostraron una expresión variable de marcadores relacionados con la identificación de enfermedades y posibles resultados, incluido MCPyV Todas las imágenes se tomaron con un aumento de 40 × con una barra de escala de 20 μM.

Para confirmar la viabilidad de las PTO en la detección terapéutica, las PTO se trataron con una serie de quimioterapias que se utilizan actualmente en el entorno clínico (Figs. 3, 4). En general, la respuesta a la terapia varió entre los PTO y los tratamientos, siendo el régimen más eficaz una combinación de cisplatino y doxorrubicina (4/6, 66 %). El análisis de regímenes combinados posiblemente puede ayudar a determinar los componentes efectivos en cada régimen paciente por paciente o diseñar nuevos protocolos terapéuticos. Por ejemplo, el conjunto de PTO MCC2 mostró una respuesta significativa hacia la combinación de cisplatino con doxorrubicina, pero un análisis más detallado de la respuesta individual muestra que la respuesta no es sinérgica sino que se debe principalmente a la citotoxicidad de la doxorrubicina (Figs. 3, 4ai–iii). Por el contrario, el conjunto de PTO MCC5 usó la misma combinación, pero la respuesta individual sugiere que el cisplatino es responsable de la eficacia del régimen (Figs. 3, 4i–iii).

La detección de quimioterapia de PTO demuestra heterogeneidad intertumoral en la respuesta al tratamiento tumoral. Los porcentajes son la viabilidad en comparación con los organoides de control emparejados con el paciente. Las dosis para los tratamientos en la tabla son las siguientes: cisplatino (10 uM), doxorrubicina (1 μM), vincristina (1 μM), etopósido (1 μM), cisplatino/doxorrubicina (10 μM/1 μM), cisplatino/etopósido (10 μM /1 μM) y vincristina/doxorrubicina (1 μM/1 μM). Los recuadros verdes representan tratamientos que dan como resultado una disminución de viabilidad <50 % y p > 0,05, los recuadros amarillos > 50 % o p < 0,05, los recuadros rojos representan tratamientos con una disminución de viabilidad > 50 % y p < 0,05. El resultado final es el número de series de PTO en las que el tratamiento es eficaz (< 50 % viable y p < 0,05). La columna en el extremo derecho representa el número de tratamientos efectivos en el respectivo conjunto de organoide del paciente.

Aplicación de plataforma de tratamiento de quimioterapia personalizada para (a) MCC2 y (b) MCC5 con (i) Cisplatino. (ii) Doxorrubicina. (iii) Vincristina. (iv) Etopósido. (v) Cisplatino/Doxorrubicina. (vi) cisplatino/etopósido y (vii) vincristina/doxorrubicina. El resumen de los resultados del ensayo CellTiter-Glo 3D para (a) MCC2 demuestra respuestas de tratamiento dependientes de la dosis para (i) cisplatino (ii) doxorrubicina (iii) cisplatino/doxorrubicina y (vii) vincristina/doxorrubicina mientras que (b) MCC5 ilustra estos resultados para (i) cisplatino y (iii) cisplatino/doxorrubicina. Debajo de cada dosis, las réplicas se enumeran como puntos de datos. * p < 0,05.

Para estudiar de manera efectiva los mecanismos detrás de la eficacia de la inmunoterapia, incorporamos células inmunitarias aisladas de sangre total o tejido de ganglio linfático normal en nuestros cultivos de PTO para formar organoides tumorales de pacientes mejorados inmunitariamente (iPTO). Tras siete días de cultivo, se realizó tratamiento de inmunoterapia con tres tratamientos aprobados para CCM: pembrolizumab, ipilimumab y nivolumab. Según nuestros criterios para la eficacia del tratamiento con iPTO de < 50 % de viabilidad de iPTO en comparación con el control con significación estadística hacia el control de iPTO combinado y el tratamiento combinado con PTO, los ensayos de viabilidad de ATP y la microscopía confocal no confirmaron un efecto de inmunoterapia significativo en nuestros organoides inmunitarios para ninguno de los los siete conjuntos iPTO probados, con un rango de viabilidad posterior al tratamiento de (55–110 %) para pembrolizumab, ipilimumab (63–108 %) y nivolumab (74–120 %) (Fig. 5). El análisis IHC de los organoides tratados demostró una citotoxicidad mediada por el sistema inmunitario mínima medida por la actividad de la granzima B y la caspasa 3 en las células tumorales, al tiempo que demostró la presencia de células T CD8+ durante el transcurso del período de estudio en comparación con los controles (Fig. 6a), Figs suplementarias . S3, S4, S5). La medición de los niveles de un marcador de estrés celular y daño tisular, LDH, en múltiples puntos de tiempo posteriores al tratamiento para MCC7 y MCC9 mostró niveles más bajos de LDH a las 24 y 48 h para MCC9, lo que sugiere resistencia iPTO a la terapia al principio del tratamiento (Fig. 6bi, ii ).

Demostración de iPTO en aplicaciones de pruebas de inmunoterapia. (a) Los conjuntos de iPTO se trataron con inmunoterapias y la viabilidad se registró con CellTiter-Glo 3D. No se determinó que las iPTO tuvieran una respuesta significativa de < 50 % de viabilidad en comparación con el control, significación estadística de p < 0,05 en comparación con el control de iPTO y el tratamiento de contraparte de la PTO para cualquier inmunoterapia probada. (b) Panel VIVO/MUERTO para MCC8. Las barras de escala representan 250 micras. * p < 0,05.

Análisis comparativo de tumores separados temporalmente en un mismo paciente. ( a ) La inmunohistoquímica de iPTO demuestra poblaciones sólidas de células T CD8 + pero una destrucción baja de células CK20 + mediada por granzima B. (b) El análisis de estrés celular LDH determina un aumento en el conjunto iPTO de pembrolizumab MCC7 pero no en MCC9, lo que sugiere la adquisición de resistencia entre los dos tumores en este paciente. Todas las imágenes tomadas con un aumento de 40X con una barra de escala de 20 μM. * p < 0,05.

La incorporación de PTO en un modelo preclínico requiere una correlación clínica. Se obtuvieron longitudinalmente un total de cuatro piezas quirúrgicas de 2 pacientes, en diferentes momentos durante su curso de tratamiento con pembrolizumab (Tabla 1). El primer paciente (MCC3) se presentó inicialmente con una lesión primaria en la cara con áreas adicionales preocupantes con actividad tumoral metastásica en el mediastino y la pelvis en las imágenes PET/CT. Este paciente fue sometido a resección del CCM primario de la cara y comenzó pembrolizumab adyuvante, siendo sometido a 4 infusiones antes de pasar de la enfermedad con los iPTO correspondientes mostrando una viabilidad postratamiento del 56% (Fig. 3).

El segundo paciente (conjuntos iPTO MCC2, MCC7, MCC9) desarrolló una recurrencia facial (MCC2), 10 años después de la resección inicial de la extremidad del MCC. PET/CT demostró nuevas áreas de metástasis en múltiples sitios en la cara y el cuello. Siete ciclos de pembrolizumab adyuvante dieron como resultado una respuesta clínica mixta al tratamiento. Más específicamente, se observó respuesta en las lesiones metastásicas del cuello mientras el paciente desarrollaba progresión de la enfermedad con una nueva lesión facial en tránsito que se resecó para el control local mientras el paciente se mantenía en tratamiento (MCC7). Dos ciclos adicionales de infusiones de pembrolizumab no impidieron el desarrollo de un nuevo tumor facial de crecimiento rápido (MCC9) que también fue resecado. La comparación de los tratamientos de quimioterapia PTO demostró una mayor resistencia a la mayoría de los tratamientos de agente único y regímenes combinados (Fig. 3). Los iPTO de MCC2 no demostraron sensibilidad del paciente hacia pembrolizumab (86 % de viabilidad posterior al tratamiento). La lesión recurrente (MCC7) demostró una viabilidad del 57% post-pembrolizumab y un aumento de LDH a las 24, 48 y 72 h post-tratamiento con pembrolizumab (Figs. 5a, 6bi). Finalmente, MCC9 no demostró sensibilidad hacia pembrolizumab con una viabilidad postratamiento del 119%, niveles reducidos de LDH y falta de actividad de granzima B y caspasa 3 (Figs. 3, 5a, 6bii). La expresión de granzima B y caspasa 3 en células tumorales PTO CK20+ tratadas disminuyó al comparar el conjunto iPTO MCC2 con conjuntos posteriores MCC7 y MCC9 (Fig. S5 complementaria).

El progreso en la investigación de MCC se ha visto obstaculizado durante mucho tiempo por la falta de modelos de tejido y la rareza de la enfermedad. En este documento, describimos la creación de PTO a partir de muestras quirúrgicas resecadas sin expansión celular que permite la disponibilidad operativa y la prueba rápida dentro de una semana desde la generación. Se compararon múltiples regímenes de quimioterapia e inmunoterapia para la eficacia citotóxica, lo que demuestra el potencial de seleccionar tratamientos personalizados para el paciente individual y la capacidad de escalar para la detección terapéutica en ensayos preclínicos. Además, la respuesta clínica a la inmunoterapia de cuatro muestras de MCC derivadas de dos pacientes fue concordante con la respuesta exhibida por sus correspondientes iPTO. La optimización de estos PTO puede aumentar nuestra comprensión de este cáncer raro y posiblemente mejorar la selección de tratamientos sistémicos.

Desde el primer desarrollo de los PTO, se ha teorizado que pueden servir como modelo comparativo para la selección de terapias de pacientes además de su capacidad como modelo de investigación para nuevas terapias. De hecho, múltiples estudios han demostrado un alto valor predictivo positivo y negativo para PTO de una variedad de tipos de tumores21,22,23,24. Aunque los ensayos que correlacionan la PTO y la respuesta clínica varían, una disminución sustancial en la viabilidad o el crecimiento de la PTO se ha utilizado de forma rutinaria como umbral para la correlación y la eficacia citotóxica. Al utilizar un umbral estricto de reducción de viabilidad del 50 % para determinar la eficacia, hemos demostrado correlaciones de PTO tanto positivas como negativas en estudios previos sobre melanoma y cáncer apendicular15,18. En este estudio, también evaluamos la viabilidad mediante microscopía confocal y el contenido de LDH, pero estos se usaron solo como ensayos de apoyo debido al bajo rendimiento. Se observó una correlación entre iPTO y la respuesta clínica en cuatro muestras tratadas previamente con pembrolizumab adyuvante, un inhibidor de PD-1. Los conjuntos de iPTO desarrollados a partir de muestras resecadas que no respondieron demostraron la presencia de células CD8+ con niveles bajos de granzima B, viabilidad celular posterior al tratamiento > 50 % y niveles reducidos de LDH que sugieren una baja actividad citotóxica dentro de las iPTO a pesar de la presencia de inhibidores de puntos de control. Los resultados de organoide presentados en el presente documento están sesgados artificialmente hacia la falta de respuesta a la inmunoterapia porque los pacientes correspondientes estaban fallando con la inmunoterapia y la cirugía se realizó solo para obtener un control local. Por lo tanto, estos resultados no pueden usarse para sugerir que la inmunoterapia no está funcionando para los tumores de células de Merkel. Un estudio multicéntrico de fase 2 observó una tasa de respuesta del 56 % (14/25) entre los pacientes tratados con pembrolizumab25. La respuesta mixta a la inmunoterapia que se observó clínicamente junto con la disminución en la expresión de estos marcadores histológicos en las lesiones resecadas que progresan con la inmunoterapia es una indicación de evolución clonal con clones malignos coexistentes que exhiben respuestas diferenciales al tratamiento. Esta es una clara demostración de que cualquier respuesta exhibida por los PTO refleja solo las lesiones de biopsia utilizadas para desarrollar los organoides y no necesariamente representa la respuesta general del paciente en los casos en que existe clonalidad tumoral en tumores espacialmente distintos.

La inmunoterapia para MCC se aprobó por primera vez en 2017 y, desde entonces, se han desarrollado varios agentes que han demostrado mejorar la supervivencia de los pacientes25,26,27. El deterioro de la función inmunitaria está relacionado con una mayor prevalencia de CCM, por lo que28 mejorar el reconocimiento inmunitario de las células tumorales puede proporcionar beneficios sustanciales para los pacientes tratados29. El poliomavirus de células de Merkel se identifica en aproximadamente el 80 % de los pacientes, creando una señalización tanto prooncogénica como antiapoptótica en las células afectadas30,31. Al mostrar una expresión coincidente confiable de MCPyV tanto en tumores extirpados como en PTO coincidentes, la plataforma de organoide presentada puede resultar útil para estudiar y desarrollar vectores antivirales o el desarrollo de vacunas MCC en casos en los que se incorporan células presentadoras de antígeno coincidentes del paciente en el cultivo conjunto. condiciones7,18.

La tasa de establecimiento de la toma de fuerza informada en este documento del 89% se alinea con otros estudios grandes que utilizan cánceres más comunes como el de colon y el de mama21,32 (Tabla 1). Nuestro estudio utiliza un hidrogel altamente caracterizado capaz de entrecruzamiento controlado que brinda resultados consistentes y reproducibles capaces de soportar células de tejido primario sin la necesidad de factores xenogénicos. El trabajo adicional con PTO puede permitir la creación y el despliegue de hidrogeles con composiciones altamente personalizadas para que coincidan con el tejido de interés. El flujo de trabajo de 10 días de duración para la biofabricación de organoides descrito para generar resultados de quimiosensibilidad e inmunosensibilidad presenta una herramienta de investigación traslacional capaz de integrarse perfectamente con las necesidades clínicas de un paciente y, tras la validación, podría cambiar potencialmente el panorama de cómo los médicos navegan por las decisiones de tratamiento, desde el análisis de cohortes hasta decisiones personalizadas. Esto es especialmente importante para los tumores raros en los que se carece de datos de ensayos clínicos. Por último, los PTO nos permitieron evaluar el sinergismo de varias combinaciones de quimioterapia (Fig. 3). Los pacientes podrían ahorrarse toxicidad innecesaria si los regímenes combinados pueden seleccionarse como el fármaco más eficaz en los casos en que no se observe sinergismo. El trabajo anterior demuestra la importancia de desviar el tejido de los bancos de tumores de tejidos "muertos" tradicionales a los biorrepositorios de tejidos vivos.

Si bien pudimos crear y probar un nuevo modelo de PTO para MCC, existen varias limitaciones en nuestra investigación. El poder modesto del estudio es un efecto directo de la rareza de MCC. La correlación clínica no fue posible con todas las muestras, ya que varios pacientes tenían contraindicaciones para recibir tratamiento sistémico, incluida la inmunoterapia5. La correlación clínica presentada describe un valor predictivo negativo, ya que muchos especímenes resecados se originaron de tumores clínicamente resistentes al tratamiento sistémico. Sin embargo, es lógico que la supervivencia de los pacientes esté determinada en última instancia por los clones que no responden, por lo que la identificación de los que no responden es importante para evitar tratamientos ineficaces, así como la toxicidad y el costo relacionados con el tratamiento asociado. Establecer un valor predictivo positivo será un criterio de valoración necesario en futuros estudios. Finalmente, aunque la radiación es una opción de tratamiento potencial para el MCC, no incorporamos este parámetro de tratamiento en nuestro estudio como se describió previamente en otros primarios33.

A pesar de las promesas de los PTO en la investigación de MCC y otros cánceres raros, los organoides aún no están listos para aplicarse en la práctica clínica sin datos correlativos suficientemente potentes con los resultados del paciente. La introducción de organoides como herramientas correlativas en ensayos clínicos aleatorizados prospectivos es la forma de avanzar junto con una caracterización genómica y proteómica extensa. El establecimiento de rutina y la mejora inmunológica de MCC PTO es factible directamente a partir de muestras quirúrgicas resecadas, lo que permite la investigación personalizada y la exploración de regímenes de tratamiento en el entorno preclínico.

Todos los métodos se realizaron según las pautas institucionales de acuerdo con las políticas de Wake Forest Baptist Health.

Se obtuvieron muestras de tejido, sangre y ganglios linfáticos de pacientes adultos con MCC que dieron su consentimiento informado y que se sometieron a resección entre diciembre de 2018 y enero de 2022. Las muestras se obtuvieron según un protocolo IRB aprobado por el Programa de Protección de Investigación Humana de Wake Forest. Las muestras se colocaron en medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) y se transfirieron al Wake Forest Organoid Research Center (WFORCE) para su procesamiento dentro de un marco posoperatorio de 2 horas.

Tras la recepción del tejido, los tumores se lavaron en solución salina tamponada con fosfato con 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 5 mg/mL de gentamicina y 5 mg/mL de anfotericina B durante dos ciclos de 5 min. Cuando fue posible, se extrajo una porción de cada espécimen y se utilizó para histología; esto se realizó si los tejidos eran lo suficientemente grandes para preparar estudios de organoides. Las muestras se trituraron y se colocaron en un recipiente cónico de 15 ml en una solución de 3 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 100 000 unidades de CDA/ml de colagenasa HA (001-1050; VitaCyte, Indianapolis, IN), 22 000 unidades/ml de proteasa (003 -1000; VitaCyte) y 200 U/ml de ADNasa 1 (07470; STEMCELL, Cambridge, MA) por gramo de tejido durante un máximo de 60 min con agitación a 37 °C. Tras la disolución completa del tejido, se terminó la digestión enzimática con medio de cultivo frío que contenía FBS y la solución tumoral resultante se filtró a través de un kit de filtración al vacío (SCNY0060; Millipore Sigma, Burlington, MA) y luego se centrifugó para aislar el sedimento celular. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió con tampón de lisis de glóbulos rojos (Abcam, Cambridge, Reino Unido) de acuerdo con el protocolo de la empresa. Se eliminó el tampón de lisis y se contaron las células usando un NucleoCounter NC-200 (Chemometec, Dinamarca). Se obtuvo sangre completa de los pacientes para la recuperación de linfocitos utilizando Ficoll-Paque PLUS y el protocolo correspondiente (GE Healthcare, Chicago, EE. UU.). Se obtuvo un ganglio linfático normal de un paciente para la fabricación de iPTO. Los ganglios linfáticos se procesaron de manera similar al tejido completo como se describe anteriormente.

El sedimento de células tumorales se resuspendió con hialuronano/heparina modificado con tiol (Heprasil; Advanced Biomatrix, San Diego, CA) preparado según las instrucciones del fabricante con Irgacure 2959 al 0,1 % p/v (5200, Advanced BioMatrix, San Diego, CA) agregado como una solución de fotoiniciador y colágeno metacrilado (PhotoCol; Advanced Biomatrix) de 3 mg/mL en una proporción de volumen de 1:3 a una densidad celular de 10 millones de células/mL. Los organoides tumorales derivados del paciente (PTO) se crearon sembrando 5 µL de la mezcla de hidrogel/células en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos sin tratamiento de cultivo tisular y fotoentrecruzados mediante exposición a luz ultravioleta (365 nm, 18 W/cm2) de una lámpara de punto UV BlueWave 75 V.2 (Dymax Corp., Torrington, CT) durante 1 s para reticular organoides. Los PTO se cultivaron en 200 ml de medio que contenía DMEM-F12 con 5 % de FBS, 1 % de penicilina-estreptomicina, 1 % de l-glutamina, 50 ng/ml de EGF (PHG 0313; ThermoFisher Scientific), 10 µM de Y-27632 (S1049, Selleckchem , Houston, TX) y los medios se cambian cada 3 o 4 días.

Las PTO inmunomejoradas (iPTO) se crearon mediante la combinación de células inmunocompetentes de sangre total de pacientes coincidentes (iPTO de sangre) o tejido linfático ganglionar (iPTO de linfa) en una proporción de 3: 1–5: 1 según el rendimiento celular con células tumorales y células sembradas. en placas como se describe anteriormente. Los organoides además de células tumorales y CD8+, contienen células CD4+ y APC, así como estroma como se describió previamente15,18. Los organoides se cultivaron durante 7 días antes del tratamiento.

Los organoides se trataron posteriormente después de 7 días de cultivo. Las quimioterapias incluyeron cisplatino (1, 10, 100 µM) (232120, Sigma Aldrich), doxorrubicina (0,1, 1, 10 µM) (S1208, Selleckchem), vincristina (0,1, 1, 10 µM) (V8879 Sigma Aldrich), doxorrubicina con cisplatino (0,1/1, 1/10, 10/100 µM), cisplatino con etopósido (S1125, Selleckchem) (1/0,1, 10/1, 100/10 µM) (Selleckchem) y doxorrubicina con vincristina (0,1/0,1 , 1/1, 10/10 µM). Para el tratamiento de inmunoterapia, se usaron 100 nM de pembrolizumab (A2002, Selleckchem), ipilimumab (A2001, Selleckchem) o nivolumab (A2005, Selleckchem) tanto en iPTO como en PTO en tratamientos paralelos. Se retiraron los medios de los pocillos y se añadieron soluciones de fármacos mezcladas en medios de cultivo. Los organoides permanecieron en la solución de medios tratados durante 72 h antes de la evaluación de viabilidad del punto final.

Después de 3 días de incubación en medios que contenían el fármaco, los organoides se evaluaron con ensayos de viabilidad de citotoxicidad LDH-GLO, CellTiter-Glo 3D y tinción LIVE/DEAD. La tinción LIVE/DEAD (L3224; Invitrogen, Carlsbad, CA) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante y se incubó a 37 °C durante 2 h antes de la obtención de imágenes. La formación de imágenes fluorescentes se realizó utilizando un macromicroscopio confocal Leica TCS LSI (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL). Las imágenes de los canales rojo y verde se superpusieron y apilaron en proyección máxima.

La viabilidad cuantitativa se evaluó utilizando CellTiter-Glo 3D Cell Viability (G968B; Promega, Madison, WI) y ensayos de citotoxicidad LDH-GLO (J2381; Promega). La LDH (lactosa deshidrogenasa) es una enzima que cataliza múltiples pasos necesarios en la formación de energía para la célula. La liberación de LDH es un marcador de estrés celular y puede utilizarse clínicamente para medir el daño tisular. Al observar pequeños aumentos en este marcador, es factible determinar que estas células no estén sufriendo estrés o daño celular, lo que puede utilizarse como una medida no lítica del daño celular en contraposición a CellTiter-Glo 3D, a costa de disminuir el ensayo. rendimiento Para el ensayo CellTiter-Glo 3D Cell Viability, se extrajo la mitad del medio (100 ml) de los pocillos individuales y se añadieron 100 ml de reactivo de ensayo a cada pocillo, seguido de incubación a temperatura ambiente en un agitador durante 30 min. El ensayo de citotoxicidad de LDH-GLO se realizó conservando el medio de cultivo de los días 1, 2 y 3 posteriores al tratamiento y realizando el ensayo el mismo día de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El contenido de los pocillos para ambos ensayos se transfirió a una placa de ensayo de 96 pocillos de poliestireno blanco Costar (3912; Corning, NY) y se analizó con un luminómetro de microplaca Veritas (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA).

Los organoides se fijaron para histología el día 10 de cultivo en paraformaldehído al 4% durante 4 h. Los organoides se procesaron, se incluyeron en parafina y se seccionaron a intervalos de 5 μm para la tinción. Las secciones de organoides y tejidos se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E).

Se realizó inmunohistoquímica cromogénica para identificar PTO y poblaciones de células tisulares. La recuperación del antígeno se realizó en portaobjetos sin teñir utilizando tampón de citrato de pH 6. El tejido y los organoides se incubaron con Cytokeratin 20 (CK20, ab76126, Abcam), Pan-Cytokeratin (Pan-CK, NBP2-29429, NOVUS, Centennial, CO), Neurofilamento (NFH, 13-1300, Thermofisher, Waltham, MA), Sinaptofisina (SYP, MA5-14532, Thermofisher), cromogranina A (ChgA, ab15160, Abcam) y antígeno T del poliomavirus de células de Merkel (MCPyV, MABF2316, Millipore Sigma) anticuerpos primarios durante la noche. Se siguió la incubación del anticuerpo secundario biotinilado apropiado (abcam) durante 1 h. Luego, los portaobjetos se expusieron a la solución DAB (SK-4105, Vector Laboratories, Burlingame CA, EE. UU.) durante dos minutos y se contrastaron con hematoxilina. Las imágenes se realizaron en un microscopio Olympus BX-63 (Olympus, Tokio, Japón).

Se realizó tinción adicional con inmunohistoquímica fluorescente (IHC) para caracterizar la respuesta al tratamiento de inmunoterapia iPTO. Los portaobjetos sin teñir se sometieron a recuperación de antígenos en una solución tampón de citrato de pH 6 antes del bloqueo con Dako Protein Block durante 30 min. Se realizó IHC fluorescente con anticuerpos para caspasa 3 escindida (9661S, Cell Signaling Technologies, Danvers MA), CD-8 (ab4055, abcam), CK-20 (MA5-13263, Invitrogen) y granzima B (ab4059, abcam) para diapositivas en proporciones de 1:500, 1:200, 1:200, 1:100, 1:400, respectivamente. Después de la incubación durante la noche a 4 °C, se aplicaron anticuerpos Alexa Fluor 488 o Alexa Fluor 594 secundarios reactivos de especies apropiadas (Biotium, Fremont, CA) a las muestras durante 1 hora a una dilución de 1:1000. Luego, las secciones se incubaron con DAPI durante 5 min antes de finalizar con cubreobjetos. Se usó un microscopio fluorescente vertical Olympus BX-63 para obtener imágenes de las secciones. La cuantificación de píxeles para imágenes fluorescentes se realizó utilizando el software ImageJ FIJI.

No hay consenso en cuanto a lo que representa la eficacia terapéutica en organoides. En este documento, utilizamos un enfoque conservador para considerar que un organoide responde a la terapia, que consta de tres criterios distintos que los iPTO deben cumplir simultáneamente: (1) demostrar una reducción estadísticamente significativa en la viabilidad celular en comparación con los organoides no tratados (control) ( Ej.: control de iPTO frente a tratamiento con iPTO), y (2) demostrar una reducción estadísticamente significativa en la viabilidad celular cuando se comparan los organoides tratados de las contracondiciones inmunes mejoradas con las no inmunes mejoradas (Ej.: iPTO tratado con inmunoterapia versus PTO tratado con inmunoterapia), y ( 3) presentar una viabilidad CellTiter-Glo 3D posterior a la inmunoterapia < 50 %.

De manera similar, los PTO mejorados no inmunes deben cumplir dos criterios: (1) demostrar una reducción estadísticamente significativa en la viabilidad en comparación con los organoides de control de PTO no tratados y (2) exhibir una reducción de la viabilidad CellTiter-Glo 3D posterior a la terapia de > 50 %. Seleccionamos arbitrariamente una reducción de la viabilidad del 50 % como el umbral más bajo indicativo de respuesta al tratamiento. Este número se puede cambiar en función de la respuesta tumoral deseada que debe estudiarse o la cinética y la biología tumoral de cada paciente individual, lo que demuestra la plasticidad de la plataforma.

Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar para cada grupo experimental. Cada combinación de condiciones constaba de 3 o más organoides para el análisis. Los valores del ensayo CellTiter-Glo 3D de los organoides tratados se estandarizaron a controles de condiciones coincidentes (iPTO o PTO) antes del análisis estadístico. Se usaron dos pruebas t de muestra para evaluar si la viabilidad celular era diferente entre los grupos de comparación deseados. Se eligió un umbral riguroso para determinar si un grupo de tratamiento mostró respuesta a la terapia. Este umbral requiere que se cumplan todas las condiciones de respuesta al tratamiento (identificadas en la sección anterior) para considerar que un organoide es una respuesta al tratamiento. Este enfoque se utilizó para disminuir la probabilidad de que ocurra un error de tipo 1. Específicamente, la probabilidad de que dos pruebas t descritas anteriormente sean significativas con p < 0,05 (en lugar de que ambas indiquen evidencia de una respuesta al tratamiento) sería del 0,25 %. Además, si la probabilidad de que la viabilidad de CellTiter-Glo 3D después de la inmunoterapia fuera inferior al 50 % fuera un evento aleatorio (es decir, 50 % de probabilidad de que ocurriera por casualidad), entonces la probabilidad combinada de que los tres eventos ocurrieran simultáneamente por casualidad sería 0,125% o 12,5 en 10.000 para estudios de inmunoterapia. Se determinó que los estudios de detección de drogas tenían éxito para un paciente si las tomas de fuerza de control no tratadas demostraban una viabilidad adecuada en el día 10 de cultivo, que coincidió con la finalización de las pruebas de detección de drogas. La viabilidad adecuada se describe como un valor en blanco < 1 % de la condición de control. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., EE. UU.).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual no están disponibles públicamente debido al riesgo de que la información de identificación del paciente se base en la rareza de la enfermedad, pero están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos el trabajo de Libby McWilliams, Matthew Ebert y Kathleen Perry (Atrium Health Wake Forest Baptist Medical Center) por su asistencia en la obtención de tejidos y la gestión de datos. SDF cuenta con el apoyo de una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (T32CA247819). KIV reconoce la financiación de NIH/NCI R01CA249087, R01CA258692, Mesotelioma Research Foundation y Wake Forest Comprehensive Cancer Center.

Instituto Wake Forest de Medicina Regenerativa, Escuela de Medicina Wake Forest, Winston-Salem, NC, EE. UU.

Steven D. Forsythe, Preston Laney, Hemamylammal Sivakumar, Aleksander Skardal, Shay Soker y Konstantinos I. Votanopoulos

Departamento de Biología del Cáncer, Escuela de Medicina Wake Forest, Winston-Salem, NC, EE. UU.

Steven D. Forsythe, Aleksander Skardal, Shay Soker y Konstantinos I. Votanopoulos

Centro de Investigación de Organoides de Wake Forest (WFORCE), Winston Salem, EE. UU.

Steven D. Forsythe, Richard A. Erali, Preston Laney, Shay Soker y Konstantinos I. Votanopoulos

Departamento de Cirugía, División de Oncología Quirúrgica, Wake Forest Baptist Health, Wake Forest University, Medical Center Boulevard, Winston Salem, NC, 27157, EE. UU.

Richard A. Erali y Konstantinos I. Votanopoulos

Wake Forest Comprehensive Cancer Center, Wake Forest School of Medicine, Winston Salem, EE. UU.

Richard A. Erali, Shay Soker y Konstantinos I. Votanopoulos

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Estatal de Ohio, Columbus, OH, EE. UU.

Hemamylammal Sivakumar y Aleksander Skardal

Departamento de Patología, Escuela de Medicina de Wake Forest, Winston-Salem, NC, EE. UU.

wencheng li

La Universidad Estatal de Ohio y el Centro Integral de Cáncer Arthur G. James, Columbus, OH, EE. UU.

Alejandro Skardal

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SDF y RAE planearon y realizaron los experimentos y contribuyeron a escribir el manuscrito. HS y PL realizaron los experimentos. WL proporcionó análisis de imágenes y contribuyó a la redacción. AS y SS planificaron los experimentos y contribuyeron a la redacción. KIV proporcionó especímenes, planeó los experimentos y contribuyó a escribir el manuscrito.

Correspondencia a Konstantinos I. Votanopoulos.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Forsythe, SD, Erali, RA, Laney, P. et al. Aplicación de organoides inmunes mejorados en el modelado de la investigación personalizada del carcinoma de células de Merkel. Informe científico 12, 13865 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17921-6

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Recibido: 08 marzo 2022

Aceptado: 02 agosto 2022

Publicado: 16 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17921-6

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