Evaluación de métodos de extracción para estudios metabolómicos no dirigidos para aplicaciones futuras en modelos de infección de larvas de pez cebra

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7489 (2023) Citar este artículo

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La preparación de muestras en metabolómica no dirigida debería permitir extracciones reproducibles de tantas moléculas como sea posible. Por lo tanto, optimizar la preparación de la muestra es crucial. Este estudio comparó seis procedimientos de extracción diferentes para encontrar el más adecuado para extraer larvas de pez cebra en el contexto de un modelo de infección. Se probaron dos extracciones de una fase empleando metanol (I) y una sola fase miscible de metanol/acetonitrilo/agua (II) y dos métodos de dos fases utilizando la separación de fases entre cloroformo y combinaciones de metanol/agua (III y IV). Se usó homogeneización de perlas adicional para los métodos III y IV (III_B y IV_B). Para la evaluación del método se utilizaron nueve estándares internos y 59 moléculas de interés (MoInt) relacionadas con la infección por micobacterias. Los métodos de dos fases (III y IV) condujeron a un recuento de características más bajo, áreas de pico más altas de MoInt, especialmente aminoácidos, y coeficientes de variación más altos en comparación con las extracciones de una fase. Agregar homogeneización de perlas aumentó el número de características, las áreas de pico y los CV. La extracción I mostró áreas de pico más altas y CV más bajos que la extracción II, siendo así el método de una fase más adecuado. Las extracciones III y IV mostraron resultados similares, siendo la III más fácil de ejecutar y menos propensa a imprecisiones. Por lo tanto, para futuras aplicaciones en metabolómica de larvas de pez cebra y modelos de infección, podrían elegirse las extracciones I y III.

La metabolómica tiene como objetivo perfilar analíticamente los cambios de moléculas < 1500 Da (metaboloma) presentes en un organismo o sistema modelo en un momento determinado1,2. El metaboloma incluye metabolitos endógenos, así como metabolitos que se originan de fuentes exógenas, como las drogas. Mientras que los enfoques dirigidos se basan en la cuantificación de metabolitos seleccionados, a menudo de un grupo particular de metabolitos, la metabolómica no dirigida tiene como objetivo detectar tantos metabolitos como sea posible1,2,3. Las técnicas analíticas que se aplican a menudo para la separación de muestras incluyen la cromatografía líquida (LC) y la cromatografía de gases, que se combinan regularmente con la espectrometría de masas1,2,3. La separación por CL en enfoques no dirigidos a menudo se realiza utilizando columnas de fase reversa para la separación de metabolitos no polares, columnas de fase normal para la separación de metabolitos polares o columnas de cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) como variaciones de las columnas de fase normal, empleando una capa de agua encima de su fase estacionaria, lo que da como resultado una separación basada principalmente en la partición líquido-líquido. Las columnas Phenyl-Hexyl son columnas de fase reversa con selectividad única para moléculas aromáticas. Después de la separación de los metabolitos, se ionizan, comúnmente mediante ionización por electropulverización (ESI) o ionización a presión atmosférica, y se analizan mediante un analizador de masas, a menudo Orbitrap o instrumentos de tiempo de vuelo1,2. Los espectros de fragmentación se pueden generar en el mismo análisis usando, por ejemplo, una adquisición dependiente o independiente de los datos, o en un análisis posterior. Los datos así generados pueden luego procesarse utilizando métodos bioinformáticos como la detección de picos y el preprocesamiento, seguidos de estadísticas multivariadas para la evaluación y comparación de los espectros de fragmentación con bibliotecas de referencia para su identificación1,2,3,4,5.

Para comprender el efecto de las enfermedades, por ejemplo, la tuberculosis6, y encontrar biomarcadores para un diagnóstico o el éxito del tratamiento, a menudo se aplica la metabolómica y se observa el cambio del metaboloma del huésped. Específicamente, los cambios en el metaboloma endógeno que se originaron a partir de la infección por Mycobacterium tuberculosis se estudiaron ampliamente en humanos4,5,6,7 y en modelos animales8, incluidos ratones, cobayos, conejos y primates no humanos9. Los cambios inducidos en el metaboloma también se estudiaron utilizando la micobacteria no tuberculosa M. marinum en larvas de pez cebra (Danio rerio, ZF) como uno de sus huéspedes naturales10. Dicho modelo ZF que utiliza M. marinum se parece a las estructuras similares a granulomas, que se encuentran típicamente en su contraparte de mamíferos11,12,13,14. El genoma de ZF es aproximadamente un 70% idéntico al de los humanos15 y en varios estudios se informó un metabolismo similar al de los humanos, tanto en lo que respecta al metabolismo de xenobióticos16,17,18,19, como al metaboloma del huésped en caso de infección20,21. El modelo de larvas ZF tiene otras ventajas, que incluyen la facilidad de manejo, la transparencia óptica de embriones y larvas y menores costos monetarios, en comparación con otros organismos22,23. Además, los experimentos realizados con embriones y larvas menores de 120 h después de la fertilización (hpf) no se consideran experimentos con animales dentro de la Unión Europea (directiva de la UE, 2010/63/EU)24. Debido a la multitud de ventajas, los estudios ZF que emplean metabolómica no dirigida son hoy en día cada vez más comunes25,26, pero rara vez se utilizan en el contexto de enfermedades y M. marinum en particular20.

Durante los estudios preliminares realizados para la implementación de un modelo de infección por M. marinum en larvas ZF, la falta de material de muestra debido al pequeño tamaño de las larvas ZF condujo a una baja intensidad de señal de los metabolitos y dio como resultado metabolitos perdidos y mala repetibilidad. Se consideró necesaria la optimización de los métodos empleados, especialmente la preparación de muestras. Para cubrir una porción suficientemente grande del metaboloma, a menudo se utilizan combinaciones de diferentes métodos de extracción, separación o identificación1,2,3,27,28.

Las extracciones líquidas comúnmente utilizadas para larvas ZF y otros tejidos de peces a menudo se basan en extracciones de una fase, que consisten en uno o más solventes miscibles, como metanol, acetonitrilo y agua29 o solo metanol19. También se basan en métodos de dos fases, que consisten en dos soluciones inmiscibles30, utilizando la separación de fases entre una fase lipófila e hidrófila. Los métodos de dos fases más comunes utilizan una solución polar, por ejemplo, mezclas de metanol y agua, y una solución apolar, por ejemplo, cloroformo31,32, metil terc-butil éter33 o heptano34.

Otro enfoque es la aplicación de homogeneización adicional de muestras. Si bien algunas muestras de tejido se pueden extraer directamente con solventes, los tejidos más resistentes necesitan pasos de descomposición adicionales. Esos métodos incluyen la homogeneización química, que tiene la desventaja de una posible interferencia con el metaboloma o los siguientes procesos de extracción, o la homogeneización mecánica de las larvas, por ejemplo, triturando, batiendo las larvas con perlas o ultrasonificando35.

Este estudio tuvo como objetivo comparar diferentes procedimientos de extracción de muestras, incluyendo una fase, dos fases y dos fases con homogeneización mecánica, para encontrar el más adecuado para el uso futuro en un modelo de infección de larvas de M. marinum ZF. Se investigaron diferentes métodos basados en múltiples estrategias de evaluación de la calidad, que involucran estándares internos, las llamadas "moléculas de interés" (MoInt), y se dilucidaron las trampas y las mejoras.

La pronasa y el azul de metileno se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Alemania). NaCl, KCl, MgSO4, Ca(NO3)2 y ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) se obtuvieron de Carl Roth (Karlsruhe, Alemania). El triptófano-d5 se obtuvo de Alsachim (Illkirch Graffenstaden, Francia). Telmisartan-d7 se adquirió de Sigma (Taufkirchen, Alemania). Trimipramin-d3, bisoprolol-d5, furosemida, glibenclamida e hidroclorotiazida se obtuvieron de LGC (Wesel, Alemania). El formiato de amonio, el acetato de amonio (ambos de grado analítico), el ácido fórmico (grado LC-MS), la d-glucosa-d7 y el ácido palmítico-d31 se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania). El acetonitrilo (ACN, grado LC-MS), el metanol (MeOH, grado LC-MS) y todos los demás productos químicos y reactivos (grado analítico) eran de VWR (Darmstadt, Alemania). El cloroformo (grado de reactivo analítico) era de Fisher (Schwerte, Alemania). El agua desionizada se produjo mediante un sistema Millipore (resistencia al agua de 18,2 Ω × cm) de Merck (Darmstadt, Alemania). Los tubos de reacción y las puntas de pipeta se obtuvieron de Sarstedt (Nümbrecht, Alemania). Se obtuvieron tubos homogeneizadores de 2 ml precargados con perlas de vidrio de 0,5 mm lavadas con ácido de Biozym (Hess, Alemania).

La crianza de ZF adulta se llevó a cabo de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal de Alemania (§11 Abs. 1 TierSchG) y en base a métodos previamente documentados19,36. Las larvas de ZF dentro de las primeras 120 hpf no se consideran experimentos con animales de acuerdo con la Directiva de la UE 2010/63/UE. El mantenimiento del pez cebra, la preparación de embriones y la recolección de muestras hasta la preparación de muestras se pueden encontrar en el material complementario.

Se investigaron dos extracciones de una fase (I-II) y dos extracciones de dos fases (III-IV), y la extracción I se usó para experimentos preliminares. Las extracciones en dos fases se evaluaron adicionalmente en combinación con un pretratamiento mecánico, mediante homogeneización con perlas de vidrio.

Para la homogeneización de perlas, indicada como "_B" en los resultados, se añadieron perlas de vidrio de 0,5 mm de tubos de homogeneización precargados (Biozym, Hess, Alemania) a las muestras congeladas por choque. Las muestras se homogeneizaron utilizando un homogeneizador MP Biomedicals FastPrep24 (TF, Dreieich, Alemania) durante 20 s a 6 m/s en el modo Quick Prep y luego se mantuvieron en hielo. Durante la extracción se usaron tres soluciones de refuerzo diferentes (1, 2 y 3), que contenían diferentes IS. Su contenido y la selección máxima del IS, así como m/z y el tiempo de retención se pueden encontrar en la Tabla S1.

Para la extracción I, adaptado de Park et al., 180 µL de MeOH y 20 µL de solución estándar interna de solución adicional 1 (25 µg/mL triptófano-d5, 1 mg/mL de ácido palmítico-d31, 50 µg/mL de glucosa-d7 en MeOH) a cada muestra19. Las muestras se agitaron en vórtex durante 10 s y luego se centrifugaron a 4 °C y 21 500 × g durante 10 min.

Para la extracción II, adaptada de Bai et al., se añadieron a cada muestra 80 µL de MeOH, 100 µL de ACN y 40 µL de agua Millipore, junto con 20 µL de la solución de adición 129. Las muestras se sonicaron con un limpiador ultrasónico USC 100T (VWR, Darmstadt, Alemania) durante 15 min a temperatura ambiente, se incubaron a -20 °C durante 2 h y luego se centrifugaron a 4 °C y 21 500 × g durante 15 min.

Para las extracciones III y III_B, adaptadas de Chai et al., se añadieron a cada muestra 180 µL de MeOH y 80 µL de agua Millipore, junto con 20 µL de la solución de refuerzo 137. Se añadieron 200 µL de cloroformo y 100 µL de agua Millipore y las muestras se agitaron en vórtex durante 1 min. Las muestras se incubaron en hielo durante 10 min y luego se centrifugaron a 4 °C y 13 800 × g durante 10 min.

Para las extracciones IV y IV_B, adaptadas de Ding et al., se añadieron a cada muestra 80 µL de MeOH y 100 µL de agua Millipore, junto con 20 µL de la solución 1 de refuerzo20. Se añadieron 200 µL de cloroformo y las muestras se sonicaron con un limpiador ultrasónico USC 100T (VWR, Darmstadt, Alemania) durante 15 min. Las muestras se incubaron en hielo durante 10 min y luego se centrifugaron a 4 °C y 2400 × g durante 5 min. Los flujos de trabajo de cada procedimiento de extracción individual se pueden encontrar en las Figs. 1 y 2

Flujo de trabajo para los procedimientos de extracción I y II. MeOH Metanol, ACN Acetonitrilo. Spike 1 solución 25 μg/mL triptófano-d5, 1 mg/mL ácido palmítico-d31, 50 μg/mL glucosa-d7 en MeOH. Generado por BioRender.com y publicado en base a sus términos de licencia académica.

Flujo de trabajo para los procedimientos de extracción III (III B) y IV (IV B). MeOH Metanol, ACN Acetonitrilo. Spike 1 solución 25 μg/mL triptófano-d5, 1 mg/mL ácido palmítico-d31, 50 μg/mL glucosa-d7 en MeOH. Generado por BioRender.com y publicado en base a sus términos de licencia académica.

Para las extracciones III, IV, III_B y IV_B, la fase lipófila inferior se descartó y no se analizó más porque la configuración analítica, incluida la ionización ESI, no estaba optimizada para los metabolitos lipófilos, además de que la mayoría de las moléculas de interés y los patrones internos eran hidrofílicos.

Después de cada procedimiento de extracción, el sobrenadante de cada muestra se transfirió a viales de vidrio marrón y se mantuvo a -80 °C durante la noche. Se añadió un volumen de 10 µL de solución adicional 2 (1 µg/mL de trimipramina-d3 y 50 µg/mL de glibenclamida en MeOH) y se eliminó el solvente usando una centrífuga de vacío (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a 30 °C, usando el ajuste para soluciones alcohólicas al vacío (V-AL) hasta 2 h, dependiendo del volumen de disolvente. Posteriormente, el residuo se reconstituyó en 50 µL de MeOH/ACN (70:30 v/v), que contenían 0,01 µg/mL de bisoprolol-d5 y telmisartán-d7, así como 10 µg/mL de hidroclorotiazida y furosemida (solución adicional 3). El extracto reconstituido se agitó durante 10 s y cada muestra se transfirió a una entrada de automuestreador. Se agruparon volúmenes de 5 µl de cada muestra y se usaron como muestra de control de calidad. Las muestras se mantuvieron en hielo seco para el transporte entre instalaciones y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

El análisis LC-HRMS/MS se realizó en base a publicaciones anteriores36,38 y los detalles sobre la instrumentación se pueden encontrar en el material complementario. Brevemente, el aparato utilizado consistió en una bomba Thermo Fisher Scientific Dionex UltiMate 3000 RS, que incluye desgasificador, bomba cuaternaria y muestreador automático UltiMate, acoplada a un TF Q-Exactive Plus (TF, Dreieich, Alemania). La fuente de iones era una fuente HESI-II de ionización por electropulverización calentada. Los parámetros para la fuente HESI-II se eligieron de acuerdo con un método previo36.

La cromatografía de fase inversa (RP) se realizó en una columna TF Accucore Phenyl-Hexyl (100 mm × 2,1 mm, 2,6 μm, TF, Dreieich, Alemania) y la cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC) utilizando una columna Nucleodur (125 mm × 3 mm , 3 μm, Macherey-Nagel, Düren, Alemania).

Los archivos sin procesar de TF se analizaron con el software TF Xcalibur versión 4.1 para el tiempo de retención, la intensidad máxima y la forma del pico para todos los IS y MoInt para garantizar la detección, identificación y posible saturación del detector correctas. Posteriormente, los archivos sin procesar se convirtieron en archivos mzXML utilizando ProteoWizard39. La selección de picos se realizó utilizando XCMS en un entorno R40. Además, los picos detectados se anotaron como isótopos, aductos y artefactos utilizando el paquete CAMERA41. La optimización de los parámetros de XCMS se realizó con base en un método publicado anteriormente42. Los parámetros optimizados de selección y alineación de picos se pueden encontrar en la Tabla S2. Después de seleccionar los picos y agrupar las muestras en características individuales, las áreas de características se corrigieron por lotes utilizando la medición repetida de las muestras de control de calidad agrupadas43.

El recuento de características se determinó y analizó mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y la prueba t de dos muestras de Welch basada en un método previamente publicado42 utilizando XCMS, comparando la extracción II, III y IV con I, III con III_B y IV con IV_B respectivamente.

Con base en las áreas de los picos de los estándares internos (IS) y MoInt, tomados del script de evaluación, los valores de la media, la desviación estándar y el CV se calcularon con Excel y los diagramas se construyeron con GraphPad PRISM 9. Además, con base en Manier y Meyer42, las áreas de los picos de los estándares internos, así como el MoInt, se analizaron mediante ANOVA y la prueba t de dos muestras de Welch, comparando cada extracción con la extracción I. La extracción I se consideró como el método de referencia, ya que se utilizó con éxito anteriormente para otros estudios de metabolómica19, como así como en experimentos preliminares.

Se aplicó ANOVA a todo el conjunto de datos generado para determinar moléculas o características significativamente diferentes entre los seis grupos de muestras diferentes, empleando la corrección de Bonferroni44 para corregir los resultados falsos positivos. Para investigar las diferencias grupales entre los métodos de extracción, se realizó un análisis de función discriminante de componentes principales (PC-DFA) utilizando las características significativas. Antes del análisis de componentes principales, el conjunto de datos se centró y el análisis discriminante posterior utilizó aquellos componentes que cumplían con el criterio de Kaiser con un mínimo de dos componentes. La calidad de la predicción se determinó utilizando la validación cruzada de Monte Carlo45.

Los archivos de datos sin procesar se cargan en MetaboLights (https://www.ebi.ac.uk/metabolights/) con el identificador de estudio MTBLS6046. El script de evaluación para el preprocesamiento de datos y el análisis estadístico en R se puede encontrar en Github (https://github.com/PhilSchip/zebrafish_extraction).

El MoInt incluyó 59 moléculas, principalmente metabolitos del huésped que se encontraron significativamente alterados en modelos de infección micobacteriana utilizando pez cebra y otras especies, así como metabolitos de experimentos preliminares de infección realizados antes de este estudio como una forma de enfoque pseudodirigido. Se incluyeron metabolitos de un estudio adicional no relacionado con la investigación de infecciones37, debido a la adaptación del método de extracción en este artículo.

En función de la m/z y el tiempo de retención, se realizó un seguimiento de la reacción en paralelo con la muestra de control de calidad agrupada para identificar el MoInt con un nivel de identificación de 2 como compuestos supuestamente anotados en lugar de clasificarse como compuestos desconocidos, utilizando un sistema de clasificación propuesto por Sumner46. Los archivos de datos se convirtieron al formato mzXML utilizando ProteoWizard39 y se importaron a NIST MS Search 2.3. Se utilizaron tres bases de datos diferentes para la identificación de compuestos: Human Metabolome Database (hmdb), NIST14 (subbases de datos nist_msms y nist_msms2) y Wiley METLIN Mass Spectral Database (subbases de datos metlin_insilico y metlin_experimental). Para la búsqueda en la biblioteca se utilizaron los siguientes parámetros, basados en una publicación anterior36: tipo de búsqueda de espectro, identidad (MS/MS); ión precursor m/z, en el espectro; pre-búsqueda, apagado. Los parámetros MS/MS fueron los siguientes: ajustes: tolerancia al precursor, ± 5 ppm; tolerancia de iones de producto, ± 10 ppm.

Para determinar la relevancia biológica de las moléculas de interés detectadas, se llevó a cabo un análisis de rutas utilizando la versión 5.0 de Metaboanalyst47. Los ID de HMDB de cada MoInt se usaron como identificadores, se conectaron a sus correspondientes identificadores de KEGG y se analizaron con la biblioteca de vías de Danio Rerio de KEGG48,47,50. Con 3-cetocolesterol que no tiene ID de HMDB y 3-metoxitirosina, estearoil etanolamida y dimetilarginina que no tienen ID de KEGG, 31 podría usarse para este análisis. El análisis se realizó utilizando diagramas de dispersión como método de visualización, prueba hipergeométrica como método de enriquecimiento, centralidad de intermediación relativa para el análisis de topología, así como utilizando todos los compuestos de la biblioteca de rutas como metaboloma de referencia.

Primero se analizaron los cuatro métodos de extracción diferentes en función del recuento de características. Si bien el recuento de características como parámetro de calidad analizado es de menor relevancia en los enfoques dirigidos, puede ser un sustituto útil para la metabolómica no dirigida. Si bien no afecta los resultados del enfoque pseudodirigido, se correlaciona mejor con la cobertura de todo el metaboloma y, por lo tanto, brinda una mayor probabilidad de detectar metabolitos deseados, pero no objetivo. Como se muestra en la Fig. 3, las extracciones I y II permitieron la detección de más características, en comparación con los métodos de dos fases III y IV. Debido a la pérdida de metabolitos lipófilos durante la separación de fases, se esperaba esta observación y se pudo eludir usando un método dedicado para sustancias lipófilas en el extracto lipófilo desechado. La única excepción fue el análisis en la columna Phenyl-Hexyl utilizando el modo de ionización positiva, donde II, III y IV estaban todos aumentados. Para la extracción II y IV la ultrasonificación y por lo tanto una mayor homogeneización de las muestras podría explicar este efecto, lo que no es cierto para la extracción III. Mirando las otras ejecuciones, no se pudo observar tal efecto de la ultrasonificación. Por lo tanto, ninguna explicación es posible a partir de ahora.

Número de características detectadas. La evaluación estadística se realizó usando ANOVA unidireccional y la prueba t de dos muestras de Welch comparando cada grupo con la extracción I. (A) Columna de fenil-hexilo, ionización positiva. (B) Columna de fenil-hexilo, ionización negativa. (C) Columna HILIC, ionización positiva. (D) Columna HILIC, ionización negativa. ns no significativo; *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001. n = 5 para cada grupo de muestra.

Aparte de esta excepción, las extracciones I y II mostraron un recuento de características muy similar, mientras que los métodos III y IV diferían en función de la polaridad del análisis. La extracción IV mostró recuentos de características más altos después de la ionización positiva (A y C) y la extracción III después de la ionización negativa (B y D), respectivamente.

En general, el modo de ionización positiva permitió la detección de más características que el modo de ionización negativa, con alrededor de 2200–6000 características en comparación con alrededor de 600–1300 características, respectivamente. También se observó que el análisis después de usar la columna HILIC mostró menos de la mitad de las características que el análisis después de usar la columna Phenyl-Hexyl.

El uso de pretratamiento mecánico condujo a un aumento significativo en el recuento de características (Fig. 4) en todas las ejecuciones realizadas. Esto indica la homogeneización exitosa de las muestras, lo que conduce a más tejido larvario descompuesto y más metabolitos liberados para la extracción.

Con base en estos resultados, los métodos de dos fases no detectaron características, muy probablemente debido a la separación de las sustancias hidrofílicas y lipofílicas y al posterior descarte de esas sustancias lipofílicas. Si bien los extractos en sí deberían contener menos moléculas que interfieren, la posibilidad de perder características relevantes es problemática. Para el uso de la homogeneización de perlas, se demostró lo contrario. Un mayor recuento de características, igual o mayor en algunos casos que las extracciones de una fase, condujo a una mejor cobertura, con una mayor probabilidad de interferencia de moléculas.

Sin embargo, ambos resultados deben tratarse con cautela. Tanto las señales derivadas endógenamente, por ejemplo, que resultan de isótopos, la formación o fragmentación de aductos, como las señales artificiales de contaminantes, ruido o errores en el procesamiento de datos51 pueden conducir a una variación significativa en el recuento de características medidas.

Sin embargo, en este estudio, la baja variabilidad en cada grupo de muestra, así como la compensación de señales aleatorias erróneas por cinco extracciones repetidas por grupo, conducen a una alta confianza en estos resultados. Si bien esas variaciones aún podrían desempeñar un papel en las diferencias observadas, parece poco probable que sean una parte importante.

Estos resultados indican diferencias entre cada principio de extracción, mientras que los métodos que usan el mismo principio muestran resultados mucho más cercanos en todas las funciones, como se esperaba. Si estas diferencias son relevantes para el futuro modelo de infección o afectan solo a las moléculas irrelevantes para la investigación de la infección por M. marinum, se desconoce a partir de ahora. Para evaluar más a fondo las diferencias y su relevancia, se analizaron los estándares internos y MoInt, seleccionados en función del contexto científico de una aplicación futura del procedimiento de extracción para un modelo de infección por M. marinum, en los siguientes pasos.

Los estándares internos utilizados se pueden dividir en tres grupos separados en función de su adición al comienzo de la extracción (pico 1), antes de la evaporación (pico 2) o durante la reconstitución (pico 3). Su éxito máximo de selección según la columna utilizada y la ionización, así como su tiempo de retención y m/z, se pueden encontrar en la Tabla S1. Notable es el hecho de que el triptófano-d5 y la glucosa-d7 no se detectaron usando la columna HILIC y el modo de ionización negativa, muy probablemente debido a las intensidades muy bajas y, en el caso de la glucosa-d7, además, debido a una forma de pico inusualmente ancha. Las intensidades más bajas de la IS después de la ionización negativa, especialmente después de HILIC, no pudieron evitarse. La forma del pico de glucosa-d7 después de HILIC indicó la necesidad de una optimización de la cromatografía, lo que no se hizo en el contexto de este estudio debido a la baja relevancia de los sacáridos en el MoInt, así como a la suficiente calidad de detección después de RP. cromatografía

Las áreas de los picos de cada patrón interno detectado se normalizaron sobre el área media de los picos utilizando la extracción I, utilizada como patrón de referencia por ser un método ya establecido. Estas áreas de pico normalizadas se pueden encontrar en las Figs. S2–S5. Los respectivos valores de CV se pueden encontrar en las Figs. S6–S9. Además, se realizaron pruebas t de dos muestras de Welch, comparando las áreas de los picos de las extracciones II, III y IV con la extracción I. Las diferencias significativas resultantes se resumen en las Tablas S3–S6.

Las áreas de los picos de triptófano-d5 fueron muy similares entre los métodos de extracción, a excepción de la extracción IV, que mostró una disminución notable en las tres corridas analíticas.

Glucosa-d7 solo se pudo detectar utilizando la columna Phenyl-Hexyl y el modo de ionización negativa, y se observaron áreas de pico muy similares, excepto un aumento para la extracción II.

El ácido palmítico-d31 mostró una diferencia significativa entre los métodos de una y dos fases. Probablemente debido a su alta lipofilia como ácido graso de cadena larga, la recuperación usando métodos de dos fases fue casi inexistente, mientras que las extracciones I y II fueron igualmente capaces de extraer ácido palmítico-d31.

Usando ionización negativa, aparte de áreas de pico más bajas para glibenclamida en la columna HILIC para extracción II, III y IV, las áreas de pico de los otros seis estándares internos probados de picos 2 y 3 fueron muy similares entre extracciones. Sin embargo, para la ionización positiva, se observó la tendencia para glibenclamida y trimipramina-d3 en la columna Phenyl-Hexyl y para el mismo IS, así como para bisoprolol-d5 y telmisartan-d7, con la extracción IV con las áreas de pico más bajas observadas. Esos IS se agregaron justo antes de la evaporación y reconstitución, esas diferencias solo pueden originarse a partir de este punto. Además de la interferencia de otras moléculas, la mayor duración de la evaporación al vacío podría ser un factor para la pérdida de intensidad. Por otro lado, se observó el mismo efecto para bisoprolol-d5 y telmisartán-d7 contenidos en la solución adicional 3, que se agregaron a la solución de reconstitución, pero solo antes del análisis basado en HILIC. Por lo tanto, la interacción de esos IS con otras moléculas durante la ejecución de LC o la adhesión a los viales de vidrio marrón no silanizados utilizados eran más probables.

En cuanto a los CV, la mayoría se encontraban entre el 5 y el 20%. Las excepciones incluyen ácido palmítico-d31 para extracciones de dos fases debido a las áreas de pico muy bajas, glucosa-d7 para extracción IV, así como glibenclamida en la columna HILIC y bisoprolol-d5, usando extracción II.

En general, todos los métodos de extracción mostraron valores de CV relativamente bajos, teniendo la extracción II la peor precisión y prefiriéndose la extracción III a la extracción IV en función de la recuperación de triptófano-d5.

Además de un aumento significativo de las áreas de los picos de furosemida (ionización negativa, columna Phenyl-Hexyl), no se pudieron observar cambios significativos en las áreas de los picos del IS. El pretratamiento mecánico condujo a un aumento de CV para el triptófano-d5 en todos los ámbitos, excepto para la extracción IV_B en la columna HILIC (ionización positiva), que mostró una reducción de ~ 2% puntos, mientras que la glucosa-d7 mostró un aumento utilizando el método III y una disminución por el método IV en el mismo orden de magnitud.

Para evaluar más a fondo las diferencias entre los métodos de extracción que podrían ser relevantes para el problema analítico elegido, se utilizó una biblioteca completa de los llamados MoInt. En total, se seleccionaron 59 MoInt para evaluación, según la literatura y los experimentos internos preliminares, que se pueden encontrar en la Tabla S7. Después de la detección y evaluación manual de los picos resultantes, quedaron 34 y 16 moléculas de esta lista, usando ionización positiva y negativa, respectivamente. Los rangos de calibración generalmente se prueban de antemano para enfoques cuantitativos y específicos para garantizar el análisis de moléculas objetivo dentro del rango dinámico de una curva de concentración-respuesta. Este enfoque no es factible para enfoques no dirigidos, debido a la amplia gama de objetivos posibles y desconocidos. Este estudio y los estudios de infección planificados adicionales están empleando un enfoque cualitativo, solo comparando cantidades relativas de MoInt entre diferentes grupos de muestras sin cuantificar la concentración de las moléculas objetivo. Sin embargo, la saturación del detector puede ser un problema incluso en estudios cualitativos y no dirigidos. Para evaluar este efecto en el contexto del estudio actual, las formas e intensidades de los picos de todos los MoInt e IS se analizaron manualmente con el software TF Xcalibur. Las señales se evaluaron en busca de signos de saturación, como formas de picos irregulares y aplanados, o intensidades de señal particularmente altas. Ninguno de estos efectos se observó en los datos de este estudio. Por lo tanto, los datos resultantes deben considerarse sólidos con respecto al MoInt y el IS analizados, mientras que debe reconocerse que para futuros estudios metabolómicos no dirigidos, los efectos de saturación deben excluirse mediante experimentos de dilución adicionales y experimentos con mayores cantidades de sustrato (en este caso, el pez cebra). larvas).

La lista de estos MoInt detectados con éxito, su subgrupo compuesto, así como su detección en cada columna, los parámetros de inclusión y el estado de identificación en función de los espectros generados en las ejecuciones de PRM de seguimiento de la muestra de control de calidad agrupada, se pueden encontrar en la Tabla 1 para modo de ionización positiva y la Tabla 2 para el modo de ionización negativa.

Al igual que las áreas de los picos de los estándares internos (consulte la Sección 3.1.2), las áreas de los picos de cada MoInt detectado se normalizaron en el área media de los picos de la extracción I y las medias de cada extracción, así como sus desviaciones estándar, pueden ser encontrado en las Figs. S10-S13. Los resultados de la prueba t de dos muestras de Welch, que compara las extracciones II, III y IV con la extracción I, se pueden encontrar en las tablas S8–S11.

En las cuatro ejecuciones analíticas, la mayoría de MoInt se detectaron con áreas de pico aproximadamente iguales a las de la extracción I, especialmente para la extracción II, siendo el método más estrechamente relacionado con la extracción I. El uso de métodos de extracción en dos fases condujo a una reducción significativa de las áreas de pico durante unos pocos MoInt, sobre todo 3-cetocolesterol, N-palmitoil-d-esfingosina y ácido inosínico. Por el contrario, una amplia gama de moléculas, especialmente aminoácidos, aumentaron significativamente. Si bien la menor recuperación se puede explicar en función de la lipofilia del MoInt afectado, el aumento de las áreas de los picos de los aminoácidos podría atribuirse a múltiples factores, por ejemplo, mayor recuperación general, mayor número de señales de interferencia para m/z similares y valores de tiempo de retención. , o menores cantidades de moléculas, interfiriendo con la ionización del MoInt.

Especialmente, un mayor número de moléculas que interfieren podría desempeñar un papel importante cuando se utiliza la columna Phenyl-Hexyl, debido a que la mayoría de los aminoácidos eluyen muy pronto dentro de los primeros 60 s.

En resumen, las extracciones en dos fases parecían tener la ventaja de una mayor recuperación de MoInt, y los métodos III y IV mostraron resultados muy similares. En cuanto a las extracciones monofásicas, la extracción I parece ser la más prometedora, con respecto a la recuperación de características. El resumen de esos hallazgos para todos los MoInt para cada extracción (Fig. 5) mostró los métodos monofásicos con áreas de picos mucho más bajas en general, y la extracción II mostró la recuperación más baja, excepto en la columna Phenyl-Hexyl que usa ionización negativa. Las extracciones III y IV mostraron resultados muy similares. En cuanto a la desviación estándar, la extracción I mostró la precisión más alta, mientras que la extracción II tuvo una precisión más baja en general, y ambos métodos de dos fases mostraron las desviaciones estándar más altas y la precisión más baja, excepto la extracción II en la columna Phenyl-Hexyl y la ionización positiva.

Media de las áreas de los picos normalizados de cada procedimiento de extracción y su respectiva desviación estándar. n = 5 para cada grupo de muestra. (A) Columna de fenil-hexilo, ionización positiva. (B) Columna de fenil-hexilo, ionización negativa. (C) Columna HILIC, ionización positiva. (D) Columna HILIC, ionización negativa.

Para visualizar la precisión de cada MoInt individual, los valores CV respectivos se muestran en las Figs. S14–S17. La mayoría de CV estaban entre el 5 y el 25%. El uso de ionización positiva conduce a resultados más precisos, en comparación con la ionización negativa, al menos en parte debido a las intensidades más bajas en general para la mayoría de los analitos en las ejecuciones negativas, especialmente aquellos detectados mediante ionización tanto positiva como negativa. La extracción II mostró en promedio los valores de CV más altos y la mayoría de las moléculas con desviaciones muy altas, mientras que las extracciones III y IV mostraron valores de CV en su mayoría a la par o ligeramente más altos en comparación con la extracción I. Algunos de los valores de CV más altos fueron además influenciados por lo mencionado anteriormente. menor recuperación de moléculas lipofílicas. La extracción I mostró los resultados más precisos para las extracciones monofásicas, mientras que la extracción III mostró un CV ligeramente más bajo para la ionización negativa y la extracción IV para la ionización positiva, respectivamente.

Las áreas de pico de las extracciones III y IV en comparación con sus contrapartes con pretratamiento agregado (extracciones III_B y IV_B) se pueden encontrar en las Figs. S18–S21 del material complementario. Resumido en la Fig. 6, ambas extracciones con pretratamiento mostraron en promedio un aumento en las áreas de los picos de MoInt. La extracción III_B mostró áreas de pico más altas para ionización negativa y áreas de pico similares o ligeramente más bajas para ionización positiva en comparación con IV_B. Las áreas de los picos más altos estuvieron acompañadas de desviaciones estándar más altas o aproximadamente iguales. Los CV del MoInt individual no mostraron tendencias claras (Figs. S22–S25). La extracción IV_B condujo a CV más altos que III_B y, en promedio, los CV fueron similares entre las respectivas extracciones con o sin pretratamiento mecánico. En resumen, la homogeneización de perlas aumentó la recuperación de MoInt manteniendo el mismo nivel exacto que su homólogo sin homogeneización añadida.

De los 35 MoInt detectados en este estudio, 31 se pudieron encontrar en la base de datos de KEGG, mientras que el cetocolesterol MoInt, la 3-metoxitirosina, la estearoil etanolamida y la dimetilarginina faltaban muy probablemente por el hecho de que son metabolitos bastante inexplorados. El 3-ketocolesterol y la estearoil etanolamida se originaron a partir de experimentos internos preliminares y, por lo tanto, solo se vinculan tentativamente con la infección por mycobacterium marinum en ZF, mientras que la 3-metoxitirosina y la dimetilarginina se vincularon con la infección por micobacterias en ZF en otro estudio20.

El resumen del análisis de la vía para los MoInts se puede encontrar en la Fig. 7. En total, se encontraron 33 vías y la mayoría de ellas están relacionadas con el metabolismo de moléculas específicas, por ejemplo, el metabolismo del triptófano, la biotina o la fenilalanina. En la Tabla S12 se puede encontrar una descripción general de todas las vías. De esas 33 vías, nueve mostraron un valor de p de 0,01 o menos, lo que indica correlaciones sólidas de MoInt y las vías. La biosíntesis de aminoacil-tRNA mostró la mayor cantidad de MoInt correlacionado. Esto se basa completamente en el hecho de que el grupo de aminoácidos es el grupo más grande de MoInt detectado y, por lo tanto, como precursores de la biosíntesis de aminoacil-tRNA parte de esta vía. Sin embargo, el puntaje de impacto relacionado con 0.00 fue muy bajo. Mucho más relevantes son las vías que combinan un alto valor de impacto y bajos valores de p. Tales vías fueron la biosíntesis de arginina y la degradación de lisina que mostraron los valores de p más bajos después de la biosíntesis de ARNt y un impacto moderado, mientras que la biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano, así como el metabolismo de alanina, aspartato y glutamato mostraron el mayor impacto. valores y, por lo tanto, es más probable que estén conectados y sean relevantes para otras vías y el metabolismo en su conjunto.

Resumen del análisis de la ruta de todos los MoInt detectados, identificando las rutas más relevantes por su impacto y valores de p ajustados. El impacto de la ruta se calculó como una combinación de centralidad y enriquecimiento de la ruta, y el valor del impacto se correlacionó positivamente con la importancia relativa de una ruta. Los colores de los círculos indican la importancia (aumentando de blanco a rojo) y los tamaños de los círculos indican el impacto de la ruta. Los resultados se generaron utilizando Metaboanalyst versión 5.0.

En resumen, el MoInt detectado y analizado en este estudio podría estar conectado a varias vías de impacto variable y, en combinación con correlaciones comprobadas con infecciones micobacterianas para la mayoría de ellas, el MoInt seleccionado podría ser útil para futuros estudios de infección que cubran una variedad de diferentes vías metabólicas.

Los metabolomas completos detectados en cada procedimiento de extracción se analizaron mediante ANOVA de una vía. Las características que mostraron una diferencia significativa entre dos grupos cualesquiera se mantuvieron para las estadísticas multivariadas. Con 3016 y 638 características significativamente diferentes después del análisis, usando la columna Phenyl-Hexyl, así como 713 y 202 después del análisis usando la columna HILIC para ionización positiva y negativa, respectivamente. Al comparar estos números con los recuentos totales de características discutidos anteriormente, alrededor del 50 % de todas las características fueron significativas en la columna Phenyl-Hexyl y alrededor del 30 % en la columna HILIC. Esto indica que la columna Phenyl-Hexyl se ve más afectada por cambios en el procedimiento de extracción. Dos posibles efectos podrían jugar un papel en este fenómeno. Primero, la diferente detectabilidad de las moléculas, basada en la separación en las diferentes columnas, lo que lleva a que se detecten más moléculas no afectadas por la extracción en la columna HILIC o viceversa. En segundo lugar, las interacciones entre diferentes moléculas, por ejemplo, la extinción de la ionización o las señales de interferencia, que serían especialmente relevantes en el primer minuto en la columna Phenyl-Hexyl. La mayoría de los aminoácidos en MoInt, así como muchas moléculas detectadas, se detectaron en esta ventana, lo que eleva la posibilidad de estas interacciones y aumenta la variabilidad de una gran cantidad de moléculas. Si bien un número similar de moléculas podría verse afectado directamente por el proceso de extracción, su coelución en la columna Phenyl-Hexyl podría elevar su efecto en el metaboloma detectado.

El siguiente PC-DFA en las Figs. 8 y 9 mostraron una buena separación entre extracciones de una fase (I y II), extracciones de dos fases (III y IV) y extracciones de dos fases con pretratamiento mecánico (III_B y IV_B). La única excepción se encontró para la columna Phenyl-Hexyl y la ionización positiva, siendo III_B y IV muy similares. Esto podría indicar un efecto similar de la homogeneización de perlas de III_B y la ultrasonificación de IV, pero esto no está respaldado por los otros resultados.

PC-DFA usando características significativas identificadas por ANOVA unidireccional. (A) Columna de fenil-hexilo, modo de ionización positiva. (B) Columna de fenil-hexilo, modo de ionización negativa. Se proporciona el número de componentes principales utilizados, la precisión de la predicción y el κ de Cohen. n = 5 para cada grupo de muestra. Las funciones discriminantes (DF1 y DF2) para maximizar la distancia entre clases y minimizar la distancia dentro de la clase se trazaron como ejes x e y, respectivamente. La adición de homogeneización de perlas se denominó "_B".

PC-DFA usando características significativas identificadas por ANOVA unidireccional. (A) Columna HILIC, ionización positiva. (B) Columna HILIC, ionización negativa. Se proporciona el número de componentes principales utilizados, la precisión de la predicción y el κ de Cohen. n = 5 para cada grupo de muestra. Las funciones discriminantes (DF1 y DF2) para maximizar la distancia entre clases y minimizar la distancia dentro de la clase se trazaron como ejes x e y, respectivamente. La adición de homogeneización de perlas se denominó "_B".

Mientras que las extracciones I y II, así como III_B y IV_B estuvieron claramente separadas en todas las ejecuciones, las extracciones III y IV no estuvieron claramente separadas para la columna HILIC, lo que indica una cobertura muy similar del metaboloma y, por lo tanto, ningún efecto significativo de las diferencias de extracción entre los dos métodos. Agregar un pretratamiento mecánico también agrega la separación, por lo que no se pudo observar un efecto consistente.

En resumen, además de la excepción mencionada anteriormente, las seis extracciones mostraron una cobertura diferente de todo el metaboloma, lo que indica que las diferencias en los procedimientos de extracción tienen un peso diferente. La separación de fases y la homogeneización de las perlas parecieron cambiar la extracción de una manera mucho más drástica que las variaciones de otros factores como los solventes de extracción, el tiempo de incubación o la adición de ultrasonificación.

Se pudieron observar varias diferencias entre los subgrupos evaluados (Tabla 3). Las extracciones de dos fases sin homogeneización de perlas mostraron el recuento de características más bajo, y los otros dos grupos tenían recuentos similares. La extracción II tuvo la recuperación más baja en este estudio, seguida de la extracción I. Ambas extracciones de dos fases tuvieron tasas de recuperación más altas, incrementadas aún más por la homogeneización de las perlas. Los valores de CV más bajos y, por lo tanto, las mejores precisiones se encontraron para la extracción I, con ambas extracciones de dos fases que mostraron en promedio CV ligeramente más altos, que aumentaron nuevamente después de la homogeneización de las perlas. En este estudio se compararon diferentes extracciones. Las extracciones de una fase conducen a la detección de más características en general y las áreas de características de MoInt fueron más bajas en la mayoría de los casos en comparación con las extracciones III y IV, especialmente en lo que respecta a los aminoácidos. Solo se redujeron unos pocos MoInt, así como el ácido palmítico-d31, muy probablemente debido a su lipofilia y la eliminación resultante en la partición de cloroformo lipofílico en extracciones de dos fases. Los CV de MoInt fueron más bajos para los métodos de una fase, especialmente la extracción I, lo que indica una mejor precisión y reproducibilidad general. La homogeneización adicional de larvas con perlas de vidrio aumentó el recuento de características y la recuperación de MoInt, al tiempo que disminuyó ligeramente la precisión. Por lo tanto, la homogeneización de perlas podría ser una posible optimización en el futuro si las ventajas de una mayor recuperación y recuento de características superan los resultados más imprecisos. En resumen, se debe preferir la extracción I a la extracción II, en función de las áreas de pico más altas de MoInt, los CV más bajos de esas áreas de pico y recuentos de características similares, así como un proceso experimental más sencillo. La extracción III y IV mostraron áreas de pico y CV similares para MoInt, pero la extracción III mostró un recuento de características más alto cuando se usaba ionización negativa, un proceso experimental más fácil y un área de pico más alta para triptófano-d5.

Es necesario realizar más experimentos que involucren el modelo de infección en sí, y ambos métodos I y III, que muestran los mejores resultados en este estudio, deben compararse más detalladamente. Para un conjunto de datos más sólido que aumente el número de muestras utilizadas, se pueden agregar experimentos repetidos, así como la posible inclusión de otros estándares internos y MoInt adicionales.

No todos los datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles públicamente, pero están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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El autor quisiera agradecer a Felix Deschner, Verena Quallaku, Armin A. Weber, Matthias J. Richter, Tanja M. Gampfer, Cathy M. Jacobs, Juel M. Schaar y Carsten Schröder por su apoyo y/o útil discusión y al HIPS -Iniciativa UdS TANDEM de apoyo.

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Departamento de Toxicología Experimental y Clínica, Centro de Señalización Molecular (PZMS), Instituto de Farmacología y Toxicología Experimental y Clínica, Universidad de Saarland, 66421, Homburg, Alemania

Philip Schippers, Lea Wagmann, Selina Hemmer, Sascha K. Manier y Markus R. Meyer

Instituto Helmholtz de Investigación Farmacéutica Saarland (HIPS), Centro Helmholtz de Investigación de Infecciones (HZI), Universidad de Saarland, Saarbrücken, Alemania

Philip Schippers, Sari Rasheed, You Me Park, Timo Risch, Rolf Muller y Jennifer Herrmann

Centro Alemán para la Investigación de Infecciones (DZIF), sitio asociado Hannover, Braunschweig, Alemania

Sari Rasheed, Timo Risch, Rolf Muller y Jennifer Herrmann

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PS, SR, SH, SKM, RM, JH, MRM diseñaron el experimento; PS, SR, YMP, TR realizaron los experimentos; PS, SR, LW, SH, SKM, JH, MRM analizaron e interpretaron los datos; PS, RM, JH, MRM escribieron y editaron el manuscrito; PS preparó las cifras; LW, SH, SKM revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Markus R. Meyer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Schippers, P., Rasheed, S., Park, YM et al. Evaluación de métodos de extracción para estudios metabolómicos no dirigidos para aplicaciones futuras en modelos de infección de larvas de pez cebra. Informe científico 13, 7489 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34593-y

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Recibido: 06 febrero 2023

Aceptado: 04 mayo 2023

Publicado: 09 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34593-y

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